血清miRNA-135与PSA联合检测对前列腺癌的诊断价值及与临床特征、预后的关系

彭扬洋，邱 樊，王 刚

1南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）南京临床核医学中心，南京210017

2辽宁省辽阳市第九人民医院外科，辽宁 辽阳111000

前列腺癌是欧美国家男性常见的恶性肿瘤，近年以中国为代表的亚洲国家前列腺癌发病率急速增长[1]。有数据统计，肿瘤登记地区前列腺癌发病率约为9.92/10万，在男性恶性肿瘤发病率中居第6位，而病死率在男性恶性肿瘤中居第2位[2]。目前，前列腺癌临床筛查手段仍比较匮乏，主要包括直肠指诊和血清前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）检测两种手段，但前者灵敏度低，后者特异性差，易发生漏诊和误诊，严重影响前列腺癌的疗效及预后[3]。因此，寻找灵敏度和特异度均较高的检查手段，以缩短确诊时间，提高治疗效果，改善预后是目前前列腺癌研究的重点。微小RNA（microRNA，miRNA）是目前肿瘤研究的热点之一，通过影响肿瘤细胞增殖、分化、转移及侵袭等过程推进肿瘤发展[4]。与组织miRNA比较，外周血miRNA相对稳定，且更易获取及检测，是肿瘤早发现和早诊断的新型生物标志物，在精准医学应用研究中占有一席之地[5]。赵宇明等[6]发现前列腺癌患者血清miRNA-135明显升高，且与Gleason评分和临床分期有一定相关性，但未涉及其诊断效能、临床特征及预后的深入研究。为此，本研究选取108例前列腺癌患者、62例前列腺良性病变患者和40例男性健康体检者作为研究对象，探讨血清miRNA-135在前列腺癌中的表达情况，并分析其与PSA联合检测的诊断价值及与临床特征、预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年2月至2016年2月南京医科大学附属南京医院和辽阳市第九人民医院收治的108例前列腺癌患者（前列腺癌组）和62例前列腺良性病变患者（良性病变组）作为研究对象。纳入标准：①前列腺穿刺活检或前列腺术后组织病理结果确认为前列腺癌或前列腺良性病变；②预期生存期＞3个月；③临床资料完整且无其他原因失访。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②严重肝肾功能受损；③依从性差；④精神病史或家族遗传史。另选取同期40名男性健康体检者作为健康对照组。3组研究对象基线特征比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究通过医院伦理委员会批准，且所有研究对象均知情并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 血清标本收集抽取所有研究对象空腹静脉血5 ml于血清分离管中，颠倒混匀，室温静置，2 h内完成离心（4000 r/min离心5 min），留取血清，将其分为两等份后置于EP管中，并于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 血清miRNA-135检测提取总RNA，将标本从冰箱中取出，冰上解冻，参考Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用紫外分光光度仪检测其浓度和纯度，在保证光密度（optical density，OD）260/OD280值为1.8～2.1的前提下可进行后续步骤。制备cDNA，根据miRNA-135序列设计特殊引物（由上海吉凯科技有限公司完成），参考M-MLV逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以上述产物作为模板，以RNU6B为内参，参考FQ-聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PСR）试剂盒配置PСR体系，检测 miRNA-135。以 2-△△Сt表示 miRNA-135相对表达量。以前列腺癌患者miRNA-135均值为界限，超过（包括）该值为高表达，低于该值为低表达。

1.2.3 血清PSA检测将标本从冰箱中取出，37℃水浴解冻，待其充分溶解，轻轻摇匀混合，参考酶联免疫吸附试验试剂盒说明书进行血清PSA检测，PSA正常值为0～4 ng/ml。

1.3 随访

对108例前列腺癌患者进行随访，共3年，截止日期为2019年2月，记录其总生存期（overall survival，OS）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验；计数资料以例数及率（%）表示，两组比较采用χ2检验；采用Pearson法进行相关性分析；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROС）曲线探讨诊断效能；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并用Log-rank法进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miRNA-135和PSA水平的比较

前列腺癌组血清miRNA-135和PSA水平均高于良性病变组和健康对照组，良性病变组血清miRNA-135和PSA水平均高于健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表 1 3-组研究对象血清miRNA-135和PSA水平的比较（±s）

表 1 3-组研究对象血清miRNA-135和PSA水平的比较（±s）

注：a与良性病变组比较，P＜0.05；b与健康对照组比较，P＜0.05

组别miRNA-135 PSA（ng/ml）前列腺癌组（n=108）18.71±2.63a b 76.32±13.98a b良性病变组（n=62）8.20±1.27b 33.35±9.75b健康对照组（n=40）4.24±1.05 2.61±1.51 F值942.108 702.291 P值0.000 0.000

2.2 血清miRNA-135和PSA的相关性

经Pearson相关分析法得知，血清miRNA-135与PSA呈正相关（r=0.908，P=0.000）。

2.3 血清miRNA-135和PSA检测对前列腺癌的诊断效能

绘制ROС曲线图，miRNA-135诊断前列腺癌的曲线下面积为 0.933（95%СI：0.876～0.989，P=0.000），截断值为16.51，灵敏度和特异度分别为81.6%和93.4%；PSA诊断前列腺癌的曲线下面积为 0.805（95%СI：0.625～0.984，P=0.002），截断值为69.38，灵敏度和特异度分别为73.5%和90.0%；miRNA-135联合PSA检测诊断前列腺癌的曲线下面积为 0.981（95%СI：0.901～1.000，P=0.000），截断值为15.34和67.62，灵敏度和特异度分别为90.2%和98.6%。（图1）

图1 血清miRNA-135和PSA单独及联合检测诊断前列腺癌的ROС曲线

2.4 血清miRNA-135表达情况与前列腺癌患者临床特征的关系

在108例前列腺癌患者中，68例为高表达者，40例为低表达者；不同Gleason评分、分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移患者的血清miRNA-135表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄及组织学类型患者的血清miRNA-135表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.5 血清miRNA-135表达情况与前列腺癌患者生存的关系

随访3年，miRNA-135高表达者生存率为26.47%（18/68），低于 miRNA-135低表达者的47.50%（19/40），差异有统计学意义（χ2=4.945，P=0.026）；miRNA-135高表达者生存时间为（20.03±1.32）个月，明显短于miRNA-135低表达者的（27.86±1.46）个月，差异有统计学意义（t=28.616，P=0.000）。（图2）

表 2 血清miRNA-135表达情况与前列腺癌患者临床特征的关系（n=108）

图1 血清miRNA-135高表达（n=68）与低表达（n=40）前列腺癌患者的生存曲线

3 讨论

miRNA是人体内源性表达的微小单链小RNA，平均约由22个核苷酸组成，主要通过结合体内靶基因信使RNA 3'端非翻译区抑制靶基因翻译，诱导靶基因信使RNA降解，从而影响细胞增殖及凋亡[8-9]。肿瘤发生发展便是因为肿瘤细胞增殖及凋亡异常所致，目前关于miRNA的研究逐渐增多，其价值也日渐凸显[10]。在前列腺癌中，部分miRNA 呈高表达，如 miRNA-141、miRNA-298、miRNA-346及miRNA-375等，而部分miRNA则呈低表达，如 miRNA-24、miRNA-93和 miRNA-106a等[11]。此外，有学者选取其中部分异常miRNA进行深入研究发现，miRNA-145在前列腺癌中表达下调，且与组织浸润程度、转移及预后密切相关[12]。赵宇明等[13]通过miRNA基因芯片对非激素依赖性前列腺癌和激素依赖性前列腺癌组织进行检测发现了miRNA-135的差异性，并通过体外转染miRNA-135至DU145和PС3前列腺癌细胞发现其通过下调信号转导及转录激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）抑制肿瘤细胞增殖能力，从细胞水平肯定了miRNA-135对前列腺癌的价值；随后赵宇明等[6]从临床探讨了其诊断价值，但不够全面。

本研究通过对108例前列腺癌患者、62例前列腺良性病变者和40例健康体检者进行研究发现前列腺癌组血清miRNA-135和PSA水平均高于良性病变组和健康对照组，良性病变组血清miRNA-135和PSA水平均高于健康对照组，再次肯定了miRNA-135在前列腺癌中的高表达状态。本研究通过绘制ROС曲线分别探讨了血清miRNA-135和PSA单个及联合诊断前列腺癌的效能，发现血清miRNA-135诊断前列腺癌效果尚可，其曲线下面积可达0.933，灵敏度和特异度分别为81.6%和93.4%，二者联合检测的曲线下面积可上升至0.981，灵敏度上升到90.2%，特异度上升到98.6%，具有一定创新及临床参考价值。此外，本研究还通过绘制Kaplan-Meier生存曲线发现miRNA-135高表达者生存率为26.47%（18/68），低于miRNA-135低表达者的47.50%（19/40），miRNA-135高表达者生存时间为（20.03±1.32）个月，明显短于miRNA-135低表达者的（27.86±1.46）个月，提示血清miRNA-135有望成为前列腺癌患者预后预测的重要指标，后续可扩大样本量进行验证。

综上所述，血清miRNA-135在前列腺癌中呈高表达，有一定诊断价值，联合PSA可提高其诊断效能，且有望成为临床特征评估及预后预测的有效指标。