胃癌相关分子分类的研究进展

高青，庄丽维

哈尔滨医科大学附属第四医院消化内科，哈尔滨 150001

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，国际癌症研究机构的报告指出，2018年全球恶性肿瘤死亡人数预计为960万（不包括非黑色素瘤皮肤癌），其中胃癌死亡人数为78万，即每12个因恶性肿瘤死亡的患者中就有1例死于胃癌，使其成为世界第三大癌症死亡原因，以及第五位最常被诊断的癌症[1]。无论是新发病例还是死亡病例，男性均是女性的两倍。尽管目前中国胃癌的发病率仍然远高于英国和美国，较之前却有所下降。据统计，2000—2011年，胃癌在中国的发病率每年下降1.8%～5.5%[2]，但病死率下降不明显，5年总生存率很低，2013—2015年胃癌患者5年生存率＜35%[3]。2018年，中国消化道癌占中国癌症总死亡人数的36.4%，而在美国及英国该比例不超过5%；胃癌死亡人数在消化道癌中占37.4%，是中国消化道癌的主要死亡原因[4]。这些可能与中国较低的早期癌症检出率及不同地区提供的不够标准的治疗策略有关。胃癌的危险因素主要有幽门螺杆菌、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染、遗传、环境、饮食及生活习惯等。对胃癌分子特性的研究不仅可以帮助提高早期诊断率，明确治疗策略，还有助于对发病机制的研究。本文通过对胃癌不同分子分类亚型的特性及其在临床中的研究进行综述，为胃癌的早期诊断及精准治疗提供思考和借鉴。

1 胃癌的不同分子分类体系

在全基因组特征研究之前，Ottini等[5]提出了自己的分类，随后Tan等[6]和Lei等[7]基于基因的特征在经过一系列的研究之后提出了新的分子分类。随着分子基因技术的发展，研究者们对胃癌分子特性的研究更加深入，癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、亚洲癌症研究组织（Asian Cancer Research Group，ACRG）等分子分类体系被进一步提出。

1.1 TCGA 的分子分类体系

2014年，TCGA研究网络基于6个分子平台对295例胃腺癌进行了鉴定：通过体细胞拷贝数分析、全外显子组测序、DNA甲基化谱、信使RNA测序、微小RNA测序和反相蛋白阵列技术、微卫星不稳定性检测和全基因组测序，最后将胃癌综合鉴定为4种分子亚型，分别为EBV阳性、微卫星不稳定（microsatellite unstable，MSI）、基因组稳定（genomically stable，GS）和染色体不稳定（chromosomally unstable，CIN）。在该项研究队列中，不同亚型发病率依次为EBV（9%）、GS（20%）、MSI（22%）、CIN（50%）[8]。

EBV相关胃癌在全球每年发生75 000～90 000例，发病率为1.3%～30.9%，全球平均发病率为10%，为EBV肿瘤中占比最大的亚群[9-10]。EBV多见于男性（81%），MSI中女性（56%）略占优势。不同国家之间各亚型的患病率具有显着差异：MSI、EBV和GS亚型之间的差异超过5倍[8]。对以上亚型在各国发病率的高度差异的研究可以确定特定分子亚型背后的分子和环境因素对胃癌发病的影响[11]。EBV多位于胃底或胃体，食管胃交界腺癌中CIN的发生率较高，MSI一般为肠型胃癌，弥漫型胃癌在GS中富集。

EBV的分子特性表现为广泛的DNA启动子的高甲基化，磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α亚型（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）的反复突变，酪氨酸受体激酶JAK2、程序性死亡受体配体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）和程序性死亡受体配体2（programmed cell death 1 ligand 2，PDCD1LG2，也称PD-L2）的扩增，超过50%的EBV阳性肿瘤中存在富含AT的交互式领域蛋白1A基因（AT-rich inter-active domain-containing protein 1A，ARID1A）突变，很少有肿瘤蛋白p53基因的突变。MSI表现为高突变负担，如DNA非整倍性、染色体的结构变化（如易位）以及各种原癌基因、肿瘤抑制基因的突变和高甲基化，尤其是作为错配修复缺陷最常见原因的DNA错配修复蛋白mutL同源物1（mutL homolog 1，MLH1）基因的启动子高甲基化[8,12]。通常使用5个微卫星标记确定MSI微卫星序列长度变化的累积[13]，根据不稳定标记的数量，将MSI分为高MSI（MSI-H）（≥2/5不稳定标记）和低MSI（MSI-L）（1/5不稳定标记）。没有不稳定标记的肿瘤被认为是微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）的。在7%～24%的胃癌中可检测到MSI-H与DNA错配修复缺陷有关[14-15]。MSI-L表型在包括胃癌在内的多种肿瘤中均有发现，但其生物学和临床意义尚不明确，MSI-L和MSS肿瘤常被合并为一组[16-17]。GS亚型通常显示负责细胞黏附的基因发生突变，如Ras同系物家族成员A基因（Ras homolog family member A，RHOA）、1型钙黏蛋白基因（cadherin 1，CDH1）和紧密连接蛋白18-Rho GTPase激活蛋白融合基因（claudin 18-rho GTPase activating protein，CLDN18-ARHGAP）。CIN表现为非整倍性和受体酪氨酸激酶的局灶性扩增，并在TP53突变中富集。研究者发现CIN亚型患者辅助化疗获益最大，GS亚型患者获益最少[18]。尽管MSI对氟尿嘧啶无反应，辅助化疗对该亚型患者缺乏明显益处，但较低的淋巴结转移率使其能代表良好的预后[19-23]。虽然EBV阳性与胃癌患者的生存预测无明显相关性[15,24]，但其对术后辅助化疗的获益具有一定提示作用：一项包含了760例胃或胃食管交界处（gastroesophageal junction，GEJ）腺癌患者的研究通过分析基于铂/5-氟尿嘧啶的术前化疗下EBV和MSI对胃癌和胃食管交界癌的诊断和预后预测意义，发现尽管MSI-H和EBV阳性不能预测铂/5-氟尿嘧啶的术前化疗的疗效，却可以提示良好的预后，而且MSI-H在不同的治疗方法中都可以代表良好的预后[25]。MSI-L可以提示单纯手术治疗患者的不良预后和术前对化疗的良好反应，因此MSI-L能帮助识别在术前接受铂/5-氟尿嘧啶治疗中获益的患者。西方国家对进展期胃癌患者采用含铂/5-氟尿嘧啶联合化疗的术前围手术期化疗，但疗效有限[26-27]，或许研究者们应该在了解不同个体的分子特性的基础上制定最佳治疗计划。相较而言，CIN和MSI亚型的总体生存率高于GS亚型，但低于EBV亚型[24,28-29]。TCGA分型提高了对发病机制及分子驱动的认识，学者们对各亚型后续的研究为该分类体系补充了预后信息。

1.2 ACRG 的分子分类体系

2015年，ACRG通过收集一家韩国转诊医院的患者，应用基因表达数据将胃癌分为四种亚型：MSI、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、MSS/TP53阳性（MSS/TP53+）和MSS/TP53阴性（MSS/TP53-）[30]。MSS/TP53+亚型与EBV感染有关。MSI组以MLH1缺失，多个致癌基因发生突变为特征。MSS和EMT具有表达EMT相关基因以及CDH1缺失的特征。通过对EMT亚型突变基因的研究发现EMT中的弥漫型患者的CDH1突变与生存期缩短有关，与疾病分期无关[31]。由于TP53是胃癌中最常见的突变基因，基于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）基因和MDM2原癌基因（MDM2 proto-oncogene，MDM2）的TP53活性信号在TP53完整的肿瘤中得分较高，而在TP53功能丧失的肿瘤中得分较低。可以将MSI和EMT以外的肿瘤分为MSS/TP53+和MSS/TP53-亚型。在MSS/TP53-样本的队列中，TP53突变发生率最高，ARID1A、PIK3CA、WNT信号通路的APC调节器基因（APC regulator of WNT signaling pathway，APC）、鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS proto-oncogene，KRAS）、SMAD家族成员4（SMAD family member 4，SMAD4）等基因的突变也较常见，且样本的非整倍性更高，癌基因如酪氨酸激酶2型受体基因（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）的扩增更多。对EMT亚型的辅助化疗或检查点阻断并没有明显的获益，可能是由于MSS/EMT患者诊断时多为晚期。在生存分析中，EMT患者预后最差，其次为TP53-肿瘤、TP53+肿瘤，最后为MSI肿瘤[30]。未来进展期胃癌的靶向治疗和免疫治疗的临床试验或许可以根据基因组或免疫学特征的差异进行设计，因为它们可能影响治疗反应和临床结果。ACRG描述的分型与明显的基因组改变、生存结局和术后复发模式相关。

1.3 通过新一代基因测序技术提出的分类体系

Li等[32]在对544例胃癌患者基因测序研究后提出了一种新的基于突变负担和突变模式的胃癌分类，他们发现不同分子亚型胃癌发病机制存在普遍而特异的突变过程，突变负担也不同，高突变胃癌表现出明显的MSI性，通过对8个显着突变基因：TP53、ARID1A、CDH1、PIK3CA、RHOA、APC、ERBB2和含2个新肌动蛋白结合重复序列基因（xin actin binding repeat containing 2，XIRP2）的区分得到C1和C2两组，系统分析后发现，C1组中TP53基因突变较多，C2组中ARID1A基因突变的比例较高。C2组还具有更多定位于胃体及弥漫型胃癌的特征。与TCGA分子亚型比较后发现C1组中CIN亚型更丰富，C2组中GS亚型和CIN亚型分布均匀。由于C1组与更好的预后结果相关，因此C1、C2亚型也可作为胃癌的预后因子。Li等[32]提出的分类代表了未来分子分类的一种方向，C1、C2亚型对胃癌治疗及预后的价值还需要进一步的探索。

1.4 GEJ肿瘤的分子分类体系

GEJ肿瘤分为食管癌和胃癌，这两种类型癌症在GEJ的区分比较困难。GEJ肿瘤的发病率在过去的50年里迅速增长，因此对该部位肿瘤进行明确的分类越来越重要。第8版美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）/国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）癌症分期手册对GEJ肿瘤分期标准的选择做出了如下定义：若肿瘤侵及胃食管交界线且肿瘤中心位于胃食管交界线以下不超过2 cm的范围，采用食管癌分期标准，若累及胃食管交界线但肿瘤中心位于胃食管交界线以下2 cm以外，以及未累及胃食管交界线的肿瘤，采用胃癌分期方法[33]，这也代表了GEJ肿瘤的解剖分类。这种分类方法虽然考虑了肿瘤的位置以指导最佳手术方式，却忽略了肿瘤的生物学特性。Bornschein等[34]用Illumina-HTv4.0芯片检测107例初治肠型胃食管腺癌患者的基因表达谱，发现了3种不同的分子亚型，它们与解剖位置、肿瘤分期或分级无关，只与表达的关键通路有关：第一种亚型上调了可以增加黏膜抵抗反流能力的胃特异性基因的表达；第二种亚型表达活跃在肠道和胆道相关代谢途径的肠道特异性基因；第三种亚型的活性基因与炎症调控相关。以上3种亚型在生物通路表达中的区别意味着这些差异可以为GEJ肿瘤的治疗提供参考。对于解剖分类存在争议的肿瘤，根据生物特性进行分类或许是一个可以考虑的选择。

2 TCGA、ACRG 分子分类研究进展

Li等[32]和Bornschein等[34]提出的分子分类有待进一步研究，TCGA和ACRG分子分类的临床价值已经被认可，学者们将TCGA、ACRG分类与临床常用的Lauren组织病理学分类联系起来，从不同的角度探索分子亚型的临床实践。

2.1 TCGA、ACRG及Lauren分类的区别与联系

通过对TCGA及ACRG分类中分子亚型的组织病理学及基因特征的归纳，发现虽然TCGA中的GS亚型和ACRG中的EMT亚型均以弥漫型为主（分别为75%和80%），但是，一方面这两种分类体系中的其他亚型的弥漫型分布有所不同：ACRG中非EMT亚型弥漫型肿瘤的发生率为30%～46%，而TCGA中非GS亚型弥漫型肿瘤的发生率则小于25%[8,30]；另一方面，CDH1突变在TCGA的GS亚型中非常普遍（37%），但在ACRG的EMT亚型中并不常见（2.8%），TCGA的GS亚型特有的RHOA突变在ACRG的EMT亚型中也很罕见，而该突变在其他ACRG亚型中较EMT亚型更为常见。以上表明TCGA中的GS亚型和ACRG中的EMT亚型存在较大的差异。世界卫生组织（WHO）分型中的差黏附性的肿瘤（包括部分或全部由印戒细胞构成的肿瘤）对应Lauren弥漫型类型，最近的一项研究描述了与其他类型的差黏附性肿瘤相比，印戒细胞为主的肿瘤中缺乏RHOA突变[35]。这从侧面说明弥漫型胃癌与GS或EMT亚型没有确切的对应关系。尽管TCGA中的CIN亚型和ACRG中的MSS/TP53-亚型具有高度相似的结构基因组改变，二者的基因扩增都比较多，但是CIN亚型的基因扩增明显多于MSS/TP53-亚型。TCGA的CIN亚型多发生在胃近端，其发病率随着近年来西方人群近端胃癌的发生率的上升而升高，而ACRG研究中近端胃癌发病率在降低，且Lauren弥漫型的比例比TCGA研究中较高。因此TCGA、ACRG与Lauren组织病理学分类是三种独立存在的分类体系。

Birkman等[36]使用免疫组化和原位杂交技术对244例胃腺癌的分子特性进行了归纳分析，在该队列中：多见于男性的EBV阳性肠型肿瘤大多定位于胃体，大多数TP53异常的肠型肿瘤位于近端；所有MSI肿瘤均为肠型，且与总体生存率提高有关。几个受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），如ERBB2、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、间充质上皮转化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）和成纤维细胞生长因子2型受体（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2），已报告在胃癌中扩增[37]。2014年TCGA在所有EGFR或ERBB2基因扩增的肿瘤中均观察到肠型胃癌[8]。此次研究进一步证实RTK扩增在肠型肿瘤中更为普遍，所以在研究靶向治疗胃癌的RTK时，组织学亚型可能是一个需要考虑的相关因素。综上所述，在未来的临床试验中，为了提高新的靶向治疗所获得的临床效益，可能需要将组织学和分子分类方法协同应用，以更好地指导临床试验。

2.2 分子分类在临床实践中的应用研究

在TCGA的MSI和EBV亚型中，偶发性MSI胃癌的超突变特性和EBV阳性胃癌中常见的PD-L1扩增使患者易于发生免疫检查点阻断[16,38-39]。MSI和EBV阳性的肿瘤对抗程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）的治疗具有显着反应，总体反应率分别为85%和100%[23]。因此MSI和EBV可以预测胃癌患者对免疫检查点阻断剂的反应，是有用的生物标志物[40]。AJCC建议胃癌和结直肠癌患者进行MSI检测[33]。尽管新一代测序技术可能是检测MSI最敏感的方法，但是在临床中错配修复蛋白的免疫组化检测被认为是最经济有效的方法，且聚合酶链反应的结果与免疫组化的结果有很好的一致性。由此可见，基于潜在的治疗及预后意义，在常规临床实践中将EBV的原位杂交和MSI的免疫组化检测结果纳入病理报告可能是有益的[40]。

3 小结与展望

从组织学和分子角度看，胃癌是一种异质性疾病。目前组织病理学仍广泛应用于临床，随着新出现的系统治疗方案和多模式治疗概念在治疗方法中越来越占优势，了解定义不同肿瘤亚型的生物学特性变得越来越重要。分子分类研究的发展让学者们开始意识到在评估组织病理学的同时评估胃癌的分子特性，使其共同指导临床决策的重要性。目前对TCGA、ACRG各分子亚型及临床特性已经有了初步的了解，新的分子亚型还在等待进一步研究。随着新一代基因测序技术的加入，未来的认识会更加深入。这些认识除了会进一步改善分子分类体系以外，还能帮助发现不同分子亚型特异的标志物，在精准治疗上更进一步。目前分子分类在临床中适用仍存在困难，除了需要进一步证明各分子亚型的临床意义以外，也需要考虑其较高的成本。因此，在确定某种分子亚型临床价值的基础上找到经济可行的普及方法也是将来需要面对的挑战。