曹晔文，肖 瑶，许 涛，王欣妍，李 露，曹 炜
（1.北京中医药大学，北京100029；2.中国中医科学院广安门医院，北京100053）
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以多关节对称性滑膜炎症为主要特征并贯穿发病全程自身免疫性疾病［1］，任何年龄段人群均可能患病，疾病的快速且不可逆的进展严重影响了病人的生活质量。其发病机制尚不明确，一般认为与外界环境、遗传因素、自体免疫状况密不可分。西医治疗RA 在缓解关节疼痛方面的作用值得肯定，但是长期使用可能导致多种不良反应的发生［2］。
中医药治疗RA 有着疗效明显，毒副作用小的特点，随着中药治疗RA 的研究日益深入，迫切需要从多成分、多靶点、多通路的角度来解释中药是如何发挥治疗作用。在现代计算机科学爆炸式发展的当下，网络药理学作为一门新兴学科，整合了生物信息学、计算机技术、药理学，使中药与疾病之间的成分-靶点-通路关系变得明朗与可视化。因此本研究基于网络药理学技术，分析“桑枝-桂枝”这一常用药对在治疗类风湿关节炎的作用通路、成分以及靶点，以期为临床研究提供一定的理论参考。
1 资料与方法
1.1 “桑枝-桂枝”活性成分与靶点预测
以“桑枝”、“桂枝”为关键词在中国中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）进行搜索，得出两味中药的化学成分。进而进行ADME 属性筛选，具体原则为口服利用度（oral bioavailability，OB 值）≥30%，类药性（drug-like，DL 值）≥0.18［3］，筛选出桑枝和桂枝的主要活性成分，除此之外，经既往文献搜索补充桂枝和桑枝的抗炎止痛有效成分，随后经Swisstargetprediction 数据库（http：//www. swisstargetprediction.ch/）预测靶点。筛选结束后，统一经过最新版Uniprot 蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org/）进行对照规范，将蛋白质靶点对照为标准基因名称，并去除非人源基因。
1.2 类风湿关节炎疾病相关靶点预测
以“Rheumatoid Arthritis”为关键词分别在人类基因数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org/），在线人类孟德尔遗传基因数据库（OMIM，https：//omim.org/）进行搜索，删除重复值并相应筛选处理后得出类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）疾病的基因。
1.3 “药物-活性成分-靶点”网络构建
利用Cytoscape 3.7.2 软件构建“桑枝-桂枝”药对-活性成分-靶点网络图，并通过Cytoscape 软件NetworkAnalyzer 功能进行网络拓扑分析，得出主要活性成分和蛋白质靶点的相关网络参数，判断“桑枝-桂枝”药对发挥作用的可能核心活性成分。
1.4 药物-疾病共同靶点预测及网络构建
将筛选过的“桑枝-桂枝”药对基因和RA 基因上传至在线韦恩图绘制网站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制韦恩图并获取药物-疾病共同靶点，这些靶点基因可认为是“桑枝-桂枝”药对治疗RA 的潜在靶点基因。
将获取得到的共同靶点基因上传至cytoscape 3.7.2 软件，利用软件构建药物-化学成分-靶点-疾病网络图，随后利用NetworkAnalyzer 功能进行网络分析，得出相关网络参数，判断药对在治疗类风湿关节炎上可能的成分和靶点。
1.5 蛋白PPI 网络构建
将获取到的药物-疾病共同靶点基因上传到STRING 在线基因数据库（https：//string-db.org/），物种选择人类（Homo sapiens），构建蛋白质相互作用网络，即PPI 网络。最小互相活动置信值设置为中等程度0.7（high confidence≥0.7），并隐藏游离蛋白（无相互作用蛋白）。将PPI 网络下载保存为Tsv格式，并导入Cytoscape 软件进行可视化处理，并利用软件内置插件MCODE，分析PPI 网络，进行关键核心通路过程描述。
1.6 生物通路富集分析和构建“药物-成分-靶标-通路”网络
将“桑枝-桂枝”药对治疗RA 的潜在靶点基因导入治疗RA 的基因通过基因功能分析网站Metascape（https：//metascape. org/gp/index. html）进行富集分析，设置P-value＜0.01，得到主要的GO和KEGG 通路后，筛选前20 条重要通路，使用Omicshare（https：//www.omicshare.com/）绘制气泡图。并基于以上得到的通路利用cytoscape 软件构建成分-靶标-通路网络，使最终结果可视化，方便分析。
2 结果
2.1 “桑枝-桂枝”活性成分与靶点结果
在TCMSP 数据库初步检索到“桑枝-桂枝”活性成分243 个，桂枝220 个，桑枝23 个。以OB≥30%，DL≥0.18 为筛选条件进行筛选桂枝主要活性成分7 个，桑枝3 个。经既往文献查询桂枝抗炎止痛成分后补充桂皮醛（Cinnamaldehyde）、肉桂酸（Cinnamic acid）［4-9］。将12 个主要活性成分经Swisstargetprediction 进行靶点预测并去除重复值和非人源基因后得到162 个靶点（表1）。
2.2 疾病靶点预测结果
以“Rheumatoid Arthritis”为关键词分别在GeneCards，OMIM 等数据库进行搜索，GeneCards 数据库得到与RA 有关的疾病基因4 329 个，根据经验取相关性分数（Relevance score）的中位数以上为有效基因，并经OMIM 等数据库取一线靶点基因进行补充，得到有效基因靶点数为2 176 个。
表1 药物活性成分Tab 1 Active ingredient of the drugs
2.3 “药物-活性成分-靶点”网络构建及分析
将获取的桂枝靶点141 个，桑枝靶点84 个导入cytoscape 3.7.2 软件绘制“药物-活性成分-靶点”网络并进行网络拓扑分析（图1）。该图共有176 个节点，237 条边。紫色六边形节点代表药物成分靶点，绿色菱形节点代表药物成分，红色圆形节点代表药物，图形大小与节点度值相关。分析显示山奈酚、β-谷甾醇、过氧麦角固醇、肉桂酸为节点较高的几个活性成分，连接度（Degree）值分别为63、37、32、30。判断其可能为“桑枝-桂枝”药对起治疗作用的主要化学活性成分。
图1 “药物-活性成分-靶点”网络Fig 1 “ Drug-active ingredient-target”network
2.4 药物-疾病共同靶点预测及网络构建及分析
将“桑枝-桂枝”162 个靶点和RA 的2 176 个靶点利用在线网站构建韦恩图，得到共同靶点85 个，认为这85 个靶点基因可能为本药对治疗RA 的潜在靶点，见表2。将潜在靶点映射回活性成分后，导入cytoscape 3.7.2 软件绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络并进行网络拓扑分析，见图2。该图共有节点99 个，356 条边。红色圆形节点代表药物，桃红色菱形代表成分，绿色八边形代表药对药物，紫色三角形代表交集基因，图形大小与度值大小成相关。山奈酚、β-谷甾醇、过氧麦角固醇、桑黄素、肉桂酸为节点较高的几个活性成分，Degree 值分别为77、49、35、29、21，说明这些化学成分可能在“桑枝-桂枝”药对在治疗RA 上重要的作用，同时多成分有着3 个及3 个以上的靶点连线，也说明了中药治疗疾病方面存在着多种“成分-靶点”共同作用的特点。
表2 药物-疾病交集基因Tab 2 Drug-disease intersection genes
2.5 蛋白质相互作用网络关系分析
将85 个共有靶点导入STRING 网站，构建PPI网络。将得到的TSV 格式文件导入Cytoscape 软件，进行可视化处理，见图3。由于PPI 网络中蛋白的关系一般是无方向的相互关系，所以归为无向图。该图共有73 个节点，306 条边，节点随着度值的增大而增大，其颜色也有明显变化。根据Degree 值≥8.36（均数），并结合核心度（Betweenness Centrality）、紧密度（Closeness Centrality）分析后，发现度值最高的5 个靶点基因：AKT1、MAPK8、TNF、JUN、PTGS2，度值分别为29、26、26、24、21。说明它们很大可能是“桑枝-桂枝”药对治疗类风湿关节炎的关键靶点基因。
根据软件内置插件MCODE 和cytoNCA，分析PPI 网络，得到关键核心通路过程，并进行描述。见图4 及表3。
2.6 通路富集分析
应用Metascape 平台对“桑枝-桂枝”药对治疗RA 的靶点基因进行GO 分析与KEGG 通路分析，利用Omicshare 平台转换成气泡图，见图5～8。气泡图的气泡大小与P 值有关。KEGG 通路富集分析得到126 条通路，分析表明该靶点基因与癌症通路（pathways in cancer）、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路（fluid shear stress and atherosclerosis）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、内分泌抵抗（endocrine resistance）、NF-κB 信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）等等有关，保留以P 值筛选的前20 条通路具体内容，见表4。GO 富集分析表明：（1）在生物过程方面（GO Biological Processes）基因显着富集的通路有：对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌起源的分子反应（response to molecule of bacterial origin）、对有毒物质的反应（response to toxic substance）、对氧化应激的反应（response to oxidative stress）、对细胞因子介导的信号通路（cytokine-mediated signaling pathway）等；（2）在细胞组分方面（GO Cellular Components）基因显着富集的通路有：膜筏（membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）、膜分区（membrane region）、浆膜外侧面（external side of plasma membrane）、膜的单侧面（side of membrane）等。（3）在分子功能（GO Molecular Functions）方面，基因显着富集的通路有蛋白质同源二聚化活动（protein homodimerization activity）、辅因子结合（cofactor binding）、血红素结合（heme binding）、脂质结合（lipid binding）、核受体活动（nuclear receptor activity）等。说明“桑枝-桂枝”药对在治疗RA 是通过复杂的分子通路以及各种机制完成的。
图2 “药物-成分-靶点-疾病”Fig 2 “ Drug-ingredient-target-disease”network
图3 经cytoscape 处理后的PPI 网络Fig 3 PPI network after cytoscape processing
图4 PPI 网络中的MCODE 模块Fig 4 Important modules in PPI network
表3 GO 关键核心通路描述Tab 3 The description of key core pathways of GO
表4 KEGG 前20 条通路Tab 4 The first 20 pathways in KEGG
图5 KEGG 通路气泡图Fig 5 The bubble diagram of KEGG pathways
图6 GO biological processes 气泡图Fig 6 The bubble diagram of GO biological processes
2.7 “药物-成分-靶标-通路”构建
图7 GO cellular components 气泡图Fig 7 The bubble diagram of GO cellular components
图8 GO molecular functions 气泡图Fig 8 The bubble diagram of GO molecular functions
将metascape 分析所得KEGG 通路资料导入Cytascape 3.7.2，构建“药物-成分-靶标-通路”，见图9。通过进行网络拓扑分析得出结论：该网络有118 个节点，503 条边，其中紫色菱形为靶点基因，红色平行四边形为“桑枝-桂枝”药对，粉紫色六边形为药物活性成分，绿色圆形为主要的KEGG 通路。分析显示，其中山奈酚度值为77，核心度0.274 079 19、紧密度0.479 508 是成分中度值最高的，合理预测山奈酚是“桑枝-桂枝”药对治疗RA 的主要作用成分。另外，网络复杂关系也表明桑枝-桂枝药对治疗RA 有着多通路-多靶点-多活性成分的特点。
图9 “ 药物-成分-靶标-通路”网络Fig 9 “ Drug-component-target-pathway”network
3 讨论
类风湿关节炎归属中医范畴中的“痹证”、“尪痹”，证型可分为风湿痹阻证、寒湿痹阻证、湿热痹阻证、痰瘀痹阻证、瘀血阻络证、气血两虚证、肝肾不足证、气阴两虚证等［10］，治疗原则为祛邪扶正兼顾。中医药联合西医目前一线治疗药物治疗类风湿关节炎所取得的效果十分明显，陈春伟等［11］实验证明独活寄生汤联合美洛昔康片治疗效果优于单单服用美洛昔康片。曹焱等［12］使用和痹方联合甲氨蝶呤片并叶酸效果，类风湿关节炎症状评分在实验前后有着明显差异，且明显优于单用西药组。秦桂福等［13］使用尪痹胶囊治疗肝肾亏虚证和风寒湿痹证患者症状改善率均为80%以上。“桑枝-桂枝”药对均有通经活络，祛风除湿的作用，是从古至今临床治疗类风湿性关节炎的常用中药药对［14，15］。古代医籍文献即有详尽记载二味中药的性味及作用，例如《图经本草》有云：“桑枝性平，不冷不热，可以常服，疗中风体痒，干湿脚气，风气四肢拘挛”、《苍生司命》“桑枝煎，诸痛风症，服此方良”，说明桑枝治疗痛风、痹证功效由来已久。《本草纲目》记载：“治一切风冷风湿，骨节挛痛，解肌开腠理，抑肝气，扶脾土，熨阴痹。”《本草问答》有云：“风淫末疾，四肢麻木疼痛，用桂枝以散寒风，用槐枝、桑枝以散热风，以枝横行，故能四达”，《本草撮要》有说：“桑枝，功专去风湿拘挛，得桂枝治肩臂痹痛”，二者配合，相须相使，能够有效提高对RA 的治疗作用。
本研究筛选出“桑枝-桂枝”药对中的主要成分为山奈酚、β-谷甾醇、肉桂酸等。实验证明山奈酚可能通过抑制bFGF-FGFR3-RSK2 信号活性、阻断MAPK 通路来进一步抑制RA 人成纤维样滑膜细胞（FLS）的增殖和迁移，抑制活化的T 细胞介导的炎性细胞因子的释放，如IL-17、TNF-α 等，同时减少破骨细胞的分化，以达到治疗类风湿关节炎的目的［16，17］。β-谷甾醇可以调节抑制巨噬细胞促炎症因子的产生，降低特异性抗体IgG 的浓度，且结果存在着浓度依赖性【18】。肉桂酸可以通过抑制脂氧合酶发挥作用，来预防或减少过敏反应的发生和影响，对治疗类风湿关节炎有着重要意义【19】。
将共同靶点基因通过GO 和KEGG 通路富集分析之后，结果发现度值大于均数8.5 以上的关键基因有HSP90AB1、PTGS2、RELA、PTGS1、BCL2、JUN、AKT1、MAPK8、IKBKB、TNF、PIK3CG、CASP3、BAX、CASP8、TLR4、MMP9 等16 个靶点基因。这些靶点参与着以直接或者间接方式调节治疗类风湿关节炎的众多复杂通路，例如TNF 信号通路、癌症通路、雌激素通路、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、NF-κB 信号通路、Toll 样信号通路、PI3K-Akt 信号通路等等。RELA 和PTGS2 基因可以调控NF-κB 通路，NF-κB 通路一方面提高滑膜细胞表达肿瘤坏死因子-α（TNF-α）炎症因子的能力，另一方面对成纤维细胞的凋亡起拮抗作用，从两方面加重了类风湿关节炎炎症发生的机率【20】。TNF基因非常重要，TNF-α 因子可以诱导负责多种生物钟基因的表达，造成类风湿患者症状出现昼夜反复的情况【21】。根据国外大型队列研究证明HSP90AB1是欧亚RA 病人常见的重叠基因之一【22】，其促进类风湿关节炎滑膜细胞肿瘤样增生，并且参加多条RA 通路的调控【23】。TLR4 是细菌内毒素的天然免疫受体，可以促进炎症反应，促进类风湿关节炎成纤维细胞的迁移。有实验证明类风湿关节炎患者比存在单纯严重关节损伤患者的滑膜组织中TLR4明显升高，关节症状与TLR4 浓度成正比【24】，从侧面也证明了研究开发TRL4 抑制剂是调控治疗类风湿关节炎的一个治疗思路【25】。AKT1、TNF、TLR4 基因参加调控PI3K-Akt 信号通路和TNF 信号通路以及IL-17 信号通路【26】，AKT1 可以通过磷酸化BAD（Bcl-2 细胞死亡拮抗剂）、维持线粒体完整性和下调FasL 的表达来抑制细胞凋亡，同时TNF-α 可以升高AKT1 的活性，造成NF-κB 通路和PI3K-Akt 信号通路的持续激活，导致炎症的持续发生以及骨质持续的被破坏【27】，据流行病学调查显示，类风湿关节炎患者性别比例中女性占比较高，尤其是女性更年期后发病概率明显增加，这可能与雌激素的水平有关系【28】。有研究表明给予去卵巢小鼠经雌激素治疗后，可以诱导Ig-G 的抗炎效应，说明有可能可以通过调控体内雌激素的含量来降低类风湿关节炎的发病风险【29】，类风湿关节炎与细胞缺氧息息相关，细胞缺氧会加速炎症因子的释放【30】。AKT1、BCL2、TLR4 等共同参与HIF-1 信号通路，有学者研究发现拮抗HIF-1 通路之后，能有效抑制滑膜巨噬细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子的表达，减少促炎细胞因子的表达并减少全身炎症症状，同时减轻类风湿关节炎的病理改变【31】。实验证明小鼠被敲除IL-17 基因之后，可能可以逆转HIF-1α 的高表达情况，减轻破骨细胞介导的骨侵蚀【32】。综上所述，“桑枝-桂枝”药对可能通过抑制TNF、NF-κB 和PI3K-Akt、HIF-1 等信号通路的表达来调控治疗类风湿关节炎。
由于个人经验以及药物煎煮后存在复杂的代谢途经，化合物和靶点的纳入存在一定局限性，可能对研究结果造成一定影响。本研究初步探讨了“桑枝-桂枝”药对的可能的关键化学成分、靶点以及通路，并且证明“桑枝-桂枝”在治疗类风湿关节炎上存在多化合物、多靶点、多信号通路的特点，并且单个化合物可调控多个靶点、单个靶点可参与多条信号通路，彼此互为影响，与目前临床研究形成对照呼应，借此希望为后续研究中药治疗类风湿关节炎提供一定的理论依据。
