武 健，李立鹏 综述,曹金凤△ 审校
1.河北医科大学研究生学院，河北石家庄 050000；2.河北医科大学第二医院生殖医学科，河北石家庄 050000
目前，单独采用常规精液分析并不能全面评估精子质量和男性生育潜力，因此，研究者将注意力转移到精子的DNA结构上。近年来，精子DNA碎片(SDF)检测作为常规精液分析的重要补充，被认为是评价精子功能的一项重要指标。研究发现，SDF与精子发生异常、氧化应激损伤、精子凋亡异常相关。精子DNA碎片指数(DFI)是指在各种不利因素的作用下，发生DNA断裂的精子占全部精子的百分比，可用于精子DNA完整性的评估。精子DNA完整性是正常受精、着床和胚胎发育的必要条件，最近的研究多集中在评估DFI在辅助生殖中的临床价值，但仍存在争议。本文将从产生机制、检测方法、临床意义和治疗方法4个方面综述SDF检测在临床的最新研究进展。
1 SDF的产生机制
1.1精子发生异常 精子形成阶段，以赖氨酸为主的组蛋白逐渐被富含精氨酸的鱼精蛋白代替。在鱼精蛋白的作用下，染色质高度折叠并存储于精子头部，以确保遗传物质的稳定性。若二者转化受阻,会导致染色质包装异常和修复缺陷，引发DNA损伤。组蛋白-鱼精蛋白转换过程复杂，受多种机制调控。GOU等[1]研究发现，PIWI基因缺失或突变与人类组蛋白异常保留有关。 组蛋白甲基化、磷酸化、乙酰化和泛素化通过表观遗传学修饰参与精子形成，可对染色质浓缩、精蛋白替代组蛋白和DNA损伤修复等过程进行调控[2]。
1.2氧化应激损伤 目前，氧化应激被认为是SDF产生最重要的发病机制。精液中的活性氧(ROS)主要来源于白细胞和未成熟精子。过量的ROS在精子细胞内积聚，会造成精子膜脂质和DNA的氧化损伤，引起DNA单链或双链的断裂。研究表明，ROS可直接造成DNA损伤[3]，而精子膜脂质过氧化可能是连接精子DNA损伤与精子形态、活力的桥梁[4]。还有研究指出，受损的精子DNA更容易受到ROS的攻击，使精子DNA损伤加重[5]。
1.3精子凋亡异常 在人类生殖系统中，凋亡可去除异常生殖细胞，这一过程受多种机制调控。精子细胞的正常凋亡有助于调控精子数量，及时清除体内染色体异常的精子和保证精子质量,若精子凋亡异常，可造成DNA损伤的精子增多。引发精子凋亡异常的机制如下：一方面，具有DNA损伤的精细胞可通过某种机制逃脱正常凋亡途径，进一步分化为成熟精子[6]；另一方面，内源性和外源性细胞凋亡信号通路激活异常可造成SDF的增加。WANG等[7]研究表明，外源性Fas/FasL信号通路激活异常与睾丸生精细胞的凋亡异常有关。RAO等[8]研究发现，内源性线粒体依赖通路可能在热诱导的生殖细胞凋亡中起关键作用。
2 SDF的检测方法
2.1精子染色质结构分析法(SCSA) SCSA作为一种间接测定精子DNA损伤的检测方法，可以对新鲜和冷冻的精液标本进行检测。DNA经酸处理变性后，用吖啶橙进行染色，与吖啶橙结合的双链DNA发出绿色荧光，而与吖啶橙结合的单链DNA发出红色荧光。利用流式细胞仪进一步评价染色细胞，被染成绿色的精子有完整的DNA,而被染成红色的精子DNA发生了变性。根据红色精子数量所占比例，可计算DFI，目前设立的参考阈值为30%。该方法的优点是不仅检测速度快，变异系数低，易于室内室间标准化，而且还能同时检测高可染性精子的百分比，评估核未完全缩合的不成熟精子情况[9]。虽然只能检测单链DNA断裂，但GAWECKA等[10]研究发现，由于相对分子质量小的吖啶橙更易与染色质结合，SCSA测试较其他方法检测DNA链断裂的灵敏度更高。
2.2末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL) TUNEL是一种以异硫氰荧光素(FITC)为标志物，利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将带有荧光标记的dUTP转移至DNA损伤分子的3′-OH末端，然后通过显微镜或流式细胞仪定量分析DNA双链和单链损伤的方法。TUNEL的缺点是操作复杂，耗时长且易受未洗净非结合标志物干扰，FITC和TdT的大分子量也会降低与高度浓缩核染色质的结合效率[10]。但是RIBEIRO等[11]研究指出，若使用标准化染色方案并优化操作步骤，TUNEL具有室间可比性。 PANNER等[12]研究也显示，TUNEL是一种直接测量真正DNA损伤的方法，如果能确定可靠的参考值，可作为不育男性个性化治疗的预后测试方法。为确定TUNEL法的参考值，已经进行了多项研究，但不同类型的TUNEL试验确定的参考值有所差异。SHARMA等[13]对95例健康男性和261例不育男性精液进行TUNEL分析发现，SDF参考值为16.8%时，特异度为91.6%，灵敏度为32.6%，阳性预测值为91.4%。但是，也有其他研究报道区分不育男性的参考值为20.3%[14]和24.3%[15]。RIBEIRO等[11]对2个实验中心的TUNEL法进行标准化后发现，SDF的平均比率有很强的正相关关系(r=0.719)。他们进一步研究发现，若采用标准TUNEL法并对2种型号流式细胞仪进行性能校正，C6流式细胞仪检测的SDF值为0～51.4%，平均值为15.1%(95%CI：10.1%～15.7%)，C6+流式细胞仪检测的SDF值为0～47.5%，平均值为14.8%(95%CI：9.9%～15.2%)，二者总体r=0.984，提示性能校正对结果一致性有重要影响[16]。
2.3彗星实验 彗星实验也称单细胞凝胶电泳,可有效检测并定量分析细胞中DNA单双链缺口损伤的程度。精子DNA受损伤后，超螺旋结构被破坏，断裂的DNA片段在电场的作用下移动到阳极形成“彗星”尾，而完整的精子DNA形成“彗星”头。在电泳过程中，由于相对分子质量小，小片段DNA比大片段DNA移动得更远。因此，通过检测荧光染料染色后“彗星”头尾的荧光强度和尾部长度,可定量分析精子不同种类的DNA损伤。该方法精子用量少，可根据电泳液pH值的不同区分DNA单链损伤和双链损伤，有助于研究不同损伤类型与不同疾病的关系。缺点是检测耗时长，操作复杂，易受电压、电流等因素的影响，临床应用较困难。
2.4精子染色质扩散实验(SCD) SCD是一种简便快速、价格低廉的间接检测SDF的方法，可以对新鲜和洗涤后精液标本进行检测。正常精子的DNA经酸变性后，可去除大部分核蛋白，使DNA环黏附在残余的核结构上形成特征光晕，而DNA完整性受损的精子不产生这种特征光晕或光晕很小。光晕的存在及大小可用来判断精子DNA的完整性。SCD的缺点是不能区分DNA单双链损伤，且光晕大小评估和背景染色难以标准化，易受主观因素影响。
由此可见，由于原理不同，4种方法在检测DNA损伤类型和相对灵敏度方面有明显差异[17]。尽管SCSA检测的室内和室间差异最小，但这项检测仍未普及[18]。对于彗星实验和SCD 2种检测方法，观察者间的变异性是主要障碍。在TUNEL分析中，检测步骤的标准化可使变异最小化，且TUNEL检测的实验室间可变性低于SCSA技术[19]。
3 SDF检测在辅助生殖中的临床意义
3.1SDF检测与男性不育 WHO推荐SDF检测作为评估男性生育力的常规检测项目[20]。WIWEKO等[21]采用SCD法检测发现，在男性不育诊断中，DFI的诊断价值高于精液分析，DFI(26.1%)是鉴别不育男性和生育男性的最佳临界值，灵敏度为80.8%，特异度为86.1%。最近，有学者对SDF与常规精液参数之间的相关性进行了研究。麦选诚等[22]研究发现，在不育男性中DFI与精子的浓度、活力和形态呈负相关，且与前向运动精子百分比的负相关关系最明显，既反映出精液常规参数能为评估精子DNA完整性提供参考，又反映出DFI对于男性生育能力预测具有科学性。EVGENI等[23]通过亚组分析发现，在健康生育人群中，常规精液参数与DFI之间的相关性差异无统计学意义，表明DFI可能是精液质量的独立指标，有必要对二者进行综合评价。
3.2SDF检测与常规体外受精(IVF) DFI与IVF结局的关系已得到广泛的研究，但结论存在争议。有研究发现，DFI增高可降低IVF受精率、妊娠率，影响胚胎质量[24]。也有研究表明，DFI与IVF受精率、优胚率、妊娠率均无关[25]。影响结果的因素有多种，如测定方法、女性生育状况、DNA损伤类型和精液处理方式等。JIN等[26]对2 085例接受IVF治疗的患者进行回顾性分析发现，DFI与妊娠率呈负相关。亚组分析发现，SDF仅在卵巢储备减少的患者中显着影响IVF结局,由此推测卵母细胞质量可能是降低SDF负面效应的重要因素。CASANOVAS等[27]对同一精液标本进行双链和单链DNA断裂分析发现，单链DNA断裂仅在原核阶段表现出主要作用，而双链DNA断裂会导致胚胎发育缓慢，并可能影响着床。可见双链DNA断裂比单链DNA断裂影响更严重，但是大多数SDF测试只鉴定单链DNA断裂，这可能是造成研究结果不一致的原因。此外，精液来源也是影响结局的混杂因素之一，多数研究只针对原始精液进行SDF检测，并不能反映优化后精子SDF的真实状态。
3.3SDF检测与卵胞浆内单精子注射(ICSI) 目前大多数证据表明，SDF对ICSI结局几乎无影响。SIMON等[28]未能发现SDF与ICSI妊娠率之间存在显着相关性，于鲁华等[29]对冻融胚胎移植周期的研究也表明，SDF引起的妊娠率下降可通过ICSI得到纠正。但是，BORGES等[30]以DFI为30%分2组探讨SDF对非男性因素不孕ICSI周期的影响,发现SDF与受精率无关，与胚胎发育不良、着床率低、流产率高有关。可能是由于ICSI过程逃避了自然选择，人为挑选了有DNA损伤的精子。 因为父系基因组于4～8细胞期被激活，所以DNA损伤对受精没有影响，但会影响后期胚胎发育。目前的研究仍存在一定的局限性，比如如何界定DFI参考值、主观因素是否会干扰胚胎质量的评价、不同胚胎培养室行ICSI前卵母细胞孵育时间长短可能会影响其修复SDF的能力等，这些因素在很大程度上限制了结果的可重复性。此外，由于DNA损伤精子受精可能会增加子代患遗传病的风险，应该对ICSI周期的患者进行密切随访，注意其遗传或出生缺陷。
3.4SDF与反复流产 我国将3次或3次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失定义为复发性流产[31]。反复流产最常见的原因是胚胎非整倍体,但对女性进行检查和核型分析发现，仍然有50%的病例反复流产无法解释。目前，关于反复流产与男性因素的研究较少。BAREH等[32]选取26例不明原因反复流产男性和31例正常生育男性，用TUNEL法检测精子SDF，结果显示反复流产组DFI(36.8%)明显高于对照组DFI(9.4%)。KHADEM等[33]在一项涉及30对特发性复发性自然流产(RSA)夫妇和30对生育夫妇(对照)的队列研究中发现，SCD法检测的RSA组DFI(43.3%)显着高于对照组DFI(16.7%)，这与LEACH等[34]研究结论一致。因此，对反复流产夫妇进行SDF检测可能为原因不明早期反复流产发病机制的研究打开突破口。
4 SDF检测用于评估各种治疗方式对DNA完整性的改善效果
4.1改变生活方式 研究发现，不良生活方式因素与氧化应激引起的SDF有关，如辐射、香烟烟雾、空气污染物、性传播感染、体质量指数等[35]。建议对有污染物暴露史或存在不良生活方式的不育男性进行SDF测试，以便通过改变生活方式降低DFI，提高生育能力。
4.2精索静脉曲张手术 ROQUE等[36]研究发现，精索静脉曲张术可减少氧化应激引起的精子DNA损伤，提高生育能力，可作为减轻SDF和提高妊娠率的一种手段。AFSIN等[37]研究指出，术后3个月即可观察到SDF情况有所改善，但是对于亚临床型的精索静脉曲张，手术似乎并不能提高生育能力[38]。
4.3药物治疗 氧化应激是破坏精子DNA完整性的重要因素，口服抗氧化剂可以减少活性氧的形成，是治疗男性不育的有效方法。ALAHMAR等[39]研究表明，维生素E、维生素C、硒、辅酶Q10、N-乙酰半胱氨酸、锌和L-肉碱可有效减少DNA断裂，但是MÉNÉZO等[40]研究指出，抗氧化处理后精子成熟染色质含量(HDS)显着增加，可能会干扰植入前发育过程中的父系基因活性，且研究提出对于精子HDS>20%的男性，不应使用抗氧化剂。
4.4精子获得方法 在高SDF男性中，使用睾丸精子代替射精精子行ICSI更好。ESTEVES等[41]研究指出，睾丸精子的SDF水平低于射精精子，ICSI周期中采用睾丸精子比射精精子有更高的活产率和更低的流产率。如果男性射精精子中SDF较高，可采用睾丸内精子抽吸术获取精子,然后行ICSI 受精可能获得较好的妊娠结局。
4.5增加性生活频率 BORGES等[42]研究表明，与禁欲时间2、3、4 d相比，禁欲时间1 d能显着减少精子射精过程中DNA的断裂，提高ICSI周期着床率、妊娠率，这可能与缩短在附睾内的储存时间和减少自由基损伤有关。SHEN等[43]利用1～3 h禁欲精子行IVF治疗并观察临床结局，证实短时间禁欲可降低SDF并改善临床结局。
4.6精液优选方法 在辅助生殖技术中，精子优选是一个常规操作，采用合适的优选技术，可降低SDF。SDF检测可用于检测这些处理技术对 DNA 完整性的影响。最近一些研究提出精液处理的新方法，QUINN等[44]研究指出，原始精液经微流控芯片优选后，SCD检测的精子DFI可降至0；BERTELI 等[45]研究发现，磁性活细胞分选法与密度梯度离心法联合使用比单独使用2种方法更能减少SDF；陈娟等[46]研究还发现，磁性活细胞分选法在降低冷冻精液DFI方面具有优势。
5 小 结
尽管检测SDF的方法有很多，但仍然缺乏统一明确的参考值，这使得SDF检测在临床的预测价值和评估价值存在争议。TUNEL技术作为检测SDF最直接的方法，评估SDF的准确性更高，在未来有更大的发展前景。如何通过优化操作步骤和规范操作流程，降低实验室室内和室间变异，仍然是SDF检测面临的巨大挑战。目前，SDF检测尚处于临床应用的起步阶段，若能够找到检测SDF的无损害方法，直接挑选DNA完整的精子用于受精，将为辅助生殖技术的选择提供安全和有效的保障。
