张志远，罗夏菲，刘荣静△
广州医科大学附属第二医院：1.检验科；2.产科，广东广州 510260
梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种慢性全身性传播疾病，在我国属于法定乙类传染病，血清学试验是临床实验室检测梅毒的常用方法。化学发光免疫分析(CLIA)法凭借其灵敏度高、特异性强、结果判定客观、适于自动化检测等诸多优点，被临床广泛应用于梅毒抗体的检测[1-2]。但是作为一种筛查方法，其检测结果中有一定比例的假阳性，临床实验室将这些假阳性结果报告出去，可能会让临床医生产生疑惑，或者给受检者带来一些麻烦和心理伤害，甚至会引起医患纠纷。为了减少因试验假阳性造成的误诊，提高检验报告准确性，可以将测定中处于临界值(Cut-off值)附近、临床意义可疑的一部分结果，设置为检测的“灰区范围”，达到提醒临床医生注意和重视的目的。笔者对本实验室使用CLIA法检出的878例梅毒抗体阳性血清标本，采用梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)为确证试验进行确认，通过研究CLIA法S/CO值与检测阳性预测值的相关关系，获得两者间的关系模型及回归方程，并以此设置本实验室CLIA法检测梅毒抗体的灰区范围，现将方法和结果报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 选择2019年1-12月广州医科大学附属第二医院检验科使用CLIA法检测梅毒抗体结果为阳性(S/CO≥1)的血清标本，共计878例。
1.2仪器与试剂 Architect i2000全自动化学发光免疫分析仪及原装配套试剂，来自美国雅培公司；TPPA试剂盒(内含溶解液、血清稀释液、致敏粒子、未致敏粒子、阳性对照血清)，为日本富士瑞必欧株式会社产品；质控品来自广东省临床检验中心。
1.3方法
1.3.1标本处理 干燥管抽取静脉血液3～5 mL，待血液自行凝固后3 500 r/min离心5 min，分离血清待检。
1.3.2CLIA的检测流程及结果判定 (1)对Architect i2000全自动化学发光免疫分析仪进行常规维护和保养；(2)项目质控监测，质控合格后开始标本的检测；(3)记录每个标本测得的S/CO值。结果判定：S/CO值≥1判定为梅毒抗体阳性，S/CO值<1判定为梅毒抗体阴性。
1.3.3TPPA的检测流程及结果判定 (1)用微量加样器将血清稀释液加入微量反应板中，第1孔100 μL，第2孔至第4孔各25 μL；(2)吸取25 μL标本至第1孔中，吹打混合均匀，然后吸出25 μL加入第2孔，以2n的方式稀释至第4孔；(3)向第3孔中滴入25 μL未致敏粒子，在第4孔中滴入25 μL致敏粒子；(4)用振荡混匀器以不会导致微量反应板内容物溅出的强度振荡混匀30 s，加盖后于室温(15～30 ℃)水平静置。2 h后，观察其反应图像并进行结果判断和记录。结果判定：观察微量反应板第3、4孔中粒子形成的反应图像，参照表1进行判断。
表1 TPPA反应图像判定表
1.4统计学处理 对878例血清标本经CLIA法检测获得的S/CO值，按照S/CO≥值1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11将标本分为6组，以TPPA结果为金标准，计算出各组CLIA法检测的阳性预测值；对各组的阳性预测值与S/CO值的关系进行曲线拟合，分析最适合的曲线模型并建立回归方程。
1.5检验体系灰区的设置 为了使灰区范围以外的阳性结果有95%以上的可信度，根据曲线拟合建立的回归方程，计算出CLIA法检测阳性预测值达到95%时的S/CO值，设为本实验室CLIA法检测血清梅毒抗体灰区范围的上限，以S/CO值=1设置为灰区的下限。
2 结 果
2.1TPPA法对878例CLIA法检测梅毒抗体呈阳性的血清标本确认结果 878例标本经TPPA法检测，确认阳性(包含弱阳性)标本779例，阴性标本99例。CLIA法的阳性预测值为88.72%。如表2所示，S/CO值在1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11的6个组的阳性预测值分别为50.77%、79.28%、89.28%、97.80%、98.57%、100.00%。
表2 S/CO值在1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11的6组标本TPPA确认结果
2.2CLIA法检测血清梅毒抗体S/CO值与检测阳性预测值的相关性分析 使用SPSS20.0软件对表2的数据进行曲线估计，表3是11种曲线模型的拟合结果，其中S型模型有统计学意义(P=0.000)，决定系数R2=0.997最高，故为最适合的模型。建立的S型模型的回归方程：Y=e-1.692/X+0.174，其中自变量X为S/CO值，因变量Y为阳性预测值。图1为S型模型的拟合曲线，可见效果比较满意。
表3 表2数据11种模型曲线拟合结果
图1 表2数据S型模型的拟合曲线
2.3灰区范围设置 根据S型曲线回归方程Y=e-1.692/X+0.174，当阳性预测值Y=0.95时，X=7.52。即S/CO=7.52时，阳性预测值可达95%。因此可设置检验体系的灰区为1≤S/CO值≤7.52。
3 讨 论
抗体检测的假阳性问题是长期以来梅毒研究者广泛关注的热点之一[3]。近年来，尽管全自动化学发光仪和检测试剂的性能都取得了很大提升，但CLIA法检测梅毒抗体假阳性问题依然没有得到令临床满意的解决方案。因此，世界各国和地区都采用了多元化的梅毒血清学诊断策略。美国疾病预防与控制中心、加拿大梅毒实验室工作小组和中国国家卫生健康委员会出台的相关指南和行业标准，都推荐了使用TPPA对CLIA法检测呈阳性的标本进行复查。多项研究也证明TPPA有较高的灵敏度和特异度，可作为梅毒抗体检测的确证试验。
在本研究中，878份CLIA法检测为阳性的标本，经TPPA检测后确认有99例实际应为阴性，即有11.28%的标本经CLIA法检测结果呈假阳性。分析其原因：(1)CLIA法检测梅毒抗体的结果判定标准是将标本中存在的梅毒抗体经过一系列反应后产生的化学发光信号与预先校准确定的Cut-off信号进行比较，根据S/CO值是否≥1确定标本是否存在梅毒抗体。为了保证检测体系有较高的灵敏度，仪器在设定Cut-off信号时会将其设定得偏低，相应地会使得检测结果S/CO值偏高，导致部分结果为假阳性。(2)标本来源。相关研究表明，恶性肿瘤、心血管疾病、肝炎、自身免疫性疾病、血液病等疾病患者的血清中可能含有某些治疗性抗体、类脂嗜异性抗体、自身抗糖尿病抗体、类风湿因子、甲胎蛋白等[4-5]，这些物质能够与试剂中的抗原成分非特异性结合，从而产生假阳性。另外，年龄也是假阳性产生的一个重要因素，一些研究表明老年人梅毒抗体测定的假阳性率偏高[6-7]，且阳性率随年龄增大呈阶梯性增高[8-10]，可能是因为老年人身体功能衰退，能够产生一些干扰化学发光反应的异常蛋白质[11]。在本研究中，99例假阳性标本中，来源是60岁以上的患者占45.5%。
对CLIA法检测梅毒抗体的检测体系进行灰区的设置，可以提高检测报告的准确性和严谨性，并能够有针对性地对标本进行复查，提高检测效率，节省成本。灰区的设置方法有多种，例如舒丰等[12]应用ROC曲线对AutoLumo A2000化学发光仪检测梅毒抗体进行了灰区设置；许晓峰等[13]认为，使用CLIA法检测梅毒抗体时，对于阳性预测值大于95%的检测结果，可以不必进行确诊试验以减少工作量。然而根据表2发现，CLIA法检测梅毒抗体的阳性预测值随S/CO值增大而升高，S/CO值与阳性预测值之间存在某种相关关系。因此本研究采用曲线拟合的方法，确认了S/CO值与阳性预测值的数量关系呈S型，并获得了两者的回归方程。通过回归方程，不仅可以计算出阳性预测值达到95%时的S/CO值，将其作为CLIA法灰区的上限，并且可以根据任何一个阳性标本的S/CO值，计算它为真阳性的概率，从某种程度上讲这比设置检验方法的灰区更有意义。国内有研究显示，CLIA法检测梅毒抗体的灵敏度和阴性预测值均为100%[14]，表明使用CLIA法检测梅毒抗体几乎可以排除假阴性情况的出现。因此，本研究可以将S/CO值=1作为灰区的下限，并将灰区范围最终设置为1≤S/CO值≤7.52。据统计，2019年本实验室梅毒抗体检测处于灰区范围外的阳性标本约为530例，若与临床医生加强沟通，注重流行病学调查，则可为这些患者节省复查费用，节约医疗资源。对于处于灰区范围内，尤其是非孕产妇、老年人、肿瘤及血液病患者等，应该进行TPPA等确证试验进行复查确认，以提高诊断准确率。
需要说明的是，入选本研究的S/CO值≥11的标本，阳性预测值达到了100%，并不代表不会出现假阳性的情况。但是这并不影响S/CO值与阳性预测值关系方程的建立，因为S/CO值≥11的分组其阳性预测值非常接近100%，将其应用于曲线估计模型时的意义并不大，也不会影响回归方程的系数。本研究在进行曲线拟合时使用了表2的前5组数据，并以每组S/CO值范围的中位数作为该组的检测阳性预测值，这可能会使曲线模型的估计及回归方程的系数产生一定偏差。
