姚宝林,张蓓蕾,岳 娟,徐妮妮,姚君诚,荣伟程,杨 潇△

1.空军军医大学第二附属医院妇产科,陕西西安710038;2.甘肃省通渭县中医医院普通外科,甘肃定西 743399;3.空军军医大学第二附属医院放射科,陕西西安710038

子宫内膜癌(UCEC)作为最严重的妇科恶性肿瘤之一,占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%[1]。UCEC起源于子宫内膜上皮,主要受雌激素的影响[2]。由于肥胖和老龄化人口的增加,UCEC的发病率和病死率逐年升高[3-4]。尽管近年来医疗技术不断进步,但由于UCEC早期诊断困难和较高的复发率,晚期UCEC患者的总体预后并无明显改善[5-6],因此,迫切需要阐明UCEC发生与发展的分子机制,进而开发用于UCEC早期诊断、预后判断的生物标志物及治疗靶点。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类缺乏蛋白编码活性的RNA分子,转录本长度均在200个核苷酸以上,可在转录、转录后及表观遗传学层面调控基因表达[7-8]。有研究表明,lncRNA作为关键调控因子可广泛参与包括UCEC在内的各类肿瘤的发生与发展[9-10]。近年来,大量lncRNAs被鉴定出在UCEC中异常表达且与患者的不良预后密切相关,其可通过影响细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管生成及耐药等生物学过程进而参与UCEC发生与发展[11-15],有成为诊断和预后判断生物标志物及治疗靶点的潜力。

LINC02321是一条转录于编码基因TTC7B和RPS6KA5之间的lncRNA,位于人类染色体14q32.11区域。最近一项有关膀胱癌的研究发现,LINC02321作为血管新生相关lncRNA,在膀胱癌中上调表达,是膀胱癌患者预后的影响因素,并可通过激活VEGFA通路促进膀胱癌细胞增殖、侵袭、迁移和顺铂耐药[16],提示LINC02321在肿瘤进展中可能发挥促癌作用。而LINC02321在UCEC中的表达是否异常及有何临床意义目前尚不清楚。因此,本研究基于生物信息学技术解析LINC02321在UCEC组织中的表达情况及其临床意义,以期为LINC02321用于UCEC早期诊断、预后判断等基础及临床转化研究提供参考依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中552例UCEC组织和35例癌旁组织(其中23例样本为配对组织)样本的基因表达谱数据及对应的临床资料作为研究对象(552例UCEC样本中部分资料不全)。其中表达谱数据通过R语言软件包“EdgeR”进行过滤和标准化处理进而获得每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本(TPM)数据,并经log2转换后用于后续分析。552例UCEC患者中年龄≤60岁207例,>60岁344例;临床分期:Ⅰ和Ⅱ期393例,Ⅲ和Ⅳ期159例;初始治疗结局:疾病进展和疾病稳定26例,部分缓解和完全缓解456例;组织学类型:子宫内膜样411例,混合性和浆液性141例;组织学分级:G1期99例,G2和G3期444例;残瘤分级:R0级377例,R1和R2级38例;肿瘤浸润程度:<50% 261例,≥50% 215例;绝经状态:绝经前期35例,围绝经期和绝经后期472例;激素治疗:无299例,有47例。

1.2方法 (1)分析LINC02321在UCEC组织中的表达及比较其临床病理特征。采用R语言软件包“EdgeR”分析LINC02321在552例UCEC组织和35例癌旁组织及23例配对UCEC组织中的表达情况;基于表达水平中位值分为高表达组和低表达组,比较两组年龄、临床分期、初始治疗结局、组织学类型、组织学分级、残瘤分级、肿瘤浸润程度、绝经状态、激素治疗等临床参数的相关性。(2)分析LINC02321与UCEC患者预后相关性。基于表达水平中位值分为高表达组和低表达组,分析LINC02321表达水平与总生存期(OS)、疾病相关生存期(DSS)及无进展间隔期(PFI)的相关性并评估生存差异。(3)分析LINC02321与UCEC免疫细胞浸润的相关性。分析LINC02321表达水平与肿瘤组织免疫细胞浸润丰度的相关性。(4)分析LINC02321对UCEC的诊断价值。(5)LINC02321在UCEC组织中的表达验证。收集20例2019年1月至2022年10月在空军军医大学第二附属医院(以下简称本院)进行手术切除的UCEC患者的肿瘤组织和癌旁组织标本,所有标本均经组织RNA保护液(德国QIAGEN)处理后于—80 ℃保存。采用TRIzol试剂(美国Thermo)提取组织总RNA,并使用UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit(康为世纪生物科技股份有限公司)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析LINC02321在UCEC组织中的表达水平。qRT-PCR采用β-Actin作为内参并通过2—ΔΔCt法计算相对表达量。引物由上海生工生物工程公司合成,序列如下:LINC02321(上游引物:5′-GGAGATGAGGACTGGGAGGT-3′和下游引物:5′-GGACAGCTGGGAAAGGAGTC-3′);β-Actin(上游引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′和下游引物:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′)。本研究所收集样本均经患者或家属同意,并签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会审核批准(批号:202108-01)。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0统计软件和R4.2.1进行数据处理与统计分析。使用R语言软件包“rms”构建Nomogram预测模型和校准曲线用于预测UCEC患者1、3和5年的OS。使用R语言包“Survival”通过 Kaplan-Meier法分析LINC02321表达水平与OS、DSS及PFI的相关性并执行log-Rank检验以评估生存差异;构建Cox比例风险回归模型分析影响OS的危险因素;通过“GSVA”R语言包利用ssGSEA算法解析LINC02321表达水平与肿瘤组织免疫细胞浸润丰度的相关性,并采用Spearman相关对LINC02321表达水平与UCEC免疫细胞浸润的相关性进行评估。采用R语言软件包“pROC”绘制受试者工作特征(ROC)曲线,通过计算曲线下面积(AUC)评价LINC02321对UCEC的诊断效能。不符合正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示,非参数两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例数或百分率表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1LINC02321在UCEC组织和癌旁组织表达情况比较 对552例UCEC组织和35例癌旁组织的表达谱数据分析发现,UCEC组织LINC02321表达水平[0.491(0.276,0.812)]高于癌旁组织[0.059(0.000,0.134)],差异有统计学意义(P<0.001)。进一步对23例配对UCEC组织的表达谱数据进行分析发现,与癌旁组织[0.053(0.000,0.148)]比较,LINC02321在肿瘤组织[0.667(0.456,0.831)]中的表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.001)。

2.2不同临床病理特征UCEC患者LINC02321低表达与高表达情况比较 UCEC患者不同年龄、临床分期、组织学类型、组织学分级、肿瘤浸润程度及激素治疗的LINC02321低表达及高表达情况比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而初始治疗结局、残瘤分级及绝经状态比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征UCEC患者LINC02321低表达与高表达情况比较[n(%)]

2.3LINC02321表达与UCEC患者生存期的相关性及OS影响因素的Cox回归分析 单因素Cox回归分析显示,UCEC患者不同年龄、临床分期、初始治疗结局、组织学类型、组织学分级、残瘤分级、肿瘤浸润程度及LINC02321表达水平是影响UCEC患者OS的因素(P<0.05)。见表2。LINC02321高表达患者的OS、DSS和PFI均明显短于低表达患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。以生存状态为因变量(死亡=0,存活=1),将表2中差异有统计学意义且与OS相关的临床参数作为自变量,纳入多因素Cox回归分析(赋值见表3),结果显示,LINC02321高表达水平(HR=1.848,P=0.036)、临床分期Ⅲ和Ⅳ(HR=3.206,P<0.001)、疾病进展和疾病稳定(HR=0.260,P<0.001)是影响UCEC患者OS的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

图1 UCEC患者的不同LINC02321表达的OS、DSS和PFI比较

表2 不同病理特征UCEC患者中位OS情况比较

表3 自变量赋值

表4 影响UCEC患者OS的多因素Cox分析

综合LINC02321表达水平、年龄、临床分期、初始治疗结局、组织学分型、组织学分级及肿瘤浸润程度等影响OS的危险因素构建Nomogram预测模型,对UCEC患者1、3和5年的OS进行预测,并利用校准曲线对模型的预测效能进行评估,结果显示,LINC02321表达水平对预测UCEC患者生存的贡献率达40%,校准曲线显示该Nomogram模型具有良好的预测效能。见图2。

注：A为构建的Nomogram预测模型;B为预测模型的校准曲线。

2.4LINC02321对UCEC的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,LINC02321表达水平对于评估UCEC(AUC=0.877)、临床分期Ⅰ(AUC=0.862)、组织学分级G1期(AUC=0.772)和肿瘤浸润(AUC=0.915)均具有一定的诊断价值。此外,LINC02321表达水平对于评估1、3、5年OS(AUC分别为0.659、0.629和0.623)、DSS(AUC分别为0.690、0.645和0.608)和PFI(AUC分别为0.633、0.602和0.612)同样具有诊断价值。

2.5LINC02321表达水平与UCEC免疫细胞浸润的关系 LINC02321表达水平与4种免疫细胞在UCEC肿瘤微环境中的浸润明显相关,其中与辅助性T淋巴细胞2(Th2)的浸润呈正相关(r=0.231,P<0.001),而与CD56bright NK细胞(r=—0.342,P<0.001)、未成熟树突状细胞(r=—0.239,P<0.001)、嗜酸粒细胞(r=—0.204,P<0.001)的浸润均呈负相关。

2.6LINC02321在UCEC组织中的表达验证 为进一步明确LINC02321在UCEC组织中的表达趋势,通过qRT-PCR分析20例UCEC患者肿瘤组织及癌旁组织中LINC02321的表达情况发现,LINC02321在UCEC组织[3.230(1.910,5.492)]中的表达水平明显高于癌旁组织[6.220(2.702,9.023)],差异有统计学意义(P<0.05),其结果与生物信息学分析结果一致。

3 讨 论

LncRNA作为重要的调控分子类型之一,因其数量庞大且在不同生理和病理状态下具有明显的组织特异性与时空特异性,已成为肿瘤诊断和预后评估新型生物标志物研发的热点分子类型[17-18]。最近有研究发现一个由6条与细胞焦亡相关的lncRNAs组成的分子标签与UCEC患者预后、免疫细胞浸润、T淋巴细胞耗竭及免疫治疗和化疗反应密切相关,对UCEC具有良好的预测能力且有望成为提高免疫治疗效果的治疗靶点[19]。

LINC02321作为一条促癌lncRNA被发现在膀胱癌中上调表达并参与肿瘤进展,且作为血管生成和基底膜相关lncRNA与其他若干lncRNA组成的分子标签可有效预测膀胱癌患者的预后和肿瘤转移[16,20],提示LINC02321在肿瘤进展中发挥着重要作用。目前,LINC02321在UCEC中的表达状况及是否参与UCEC进展还不清楚。故本研究基于TCGA数据库中UCEC的基因表达数据及临床资料,通过生物信息学分析对LINC02321在UCEC中的表达情况及临床意义进行了探讨,发现LINC02321在配对和非配对UCEC组织中的表达水平均明显高于正常组织,提示LINC02321具有作为UCEC诊断分子标志物的潜力。其次,本研究发现,LINC02321的高表达对预测UCEC患者生存期具有较大贡献,且对评估UCEC、组织学G1期、临床分期Ⅰ以及1、3、5年生存期(OS、DSS和PFI)均具有良好的预测效果,表明LINC02321的高表达与UCEC患者不良临床病理特征和预后密切相关,进一步提示LINC02321在UCEC中可能发挥促癌作用,是潜在的UCEC早期诊断和预后判断的新型分子标志物。在膀胱癌中,同样发现,LINC02321在肿瘤组织中上调表达与膀胱癌患者不良预后密切相关,并可促进膀胱癌细胞的增殖和转移[16]。本研究发现,LINC02321的高表达与多种具有抗肿瘤活性的免疫细胞(包括CD56bright NK细胞、未成熟树突状细胞和嗜酸粒细胞)在UCEC组织中的浸润丰度呈负相关,而与具有肿瘤免疫抑制功能的Th2细胞呈正相关,提示LINC02321的高表达可能与UCEC免疫抑制性肿瘤微环境的形成密切相关。最近一项在膀胱癌中的研究发现,由高表达的LINC02321与AC004034.1、AL662797.1、NR2F1-AS1、SETBP1-DT、AC011503.2、AC093010.2、 LINC00649一并组成的lncRNA分子标签,与B淋巴细胞、滤泡Th(TFH)、调节性T淋巴细胞及活化型树突状细胞(aDC)的浸润均呈负相关,而与NK细胞的浸润呈正相关[20],提示在不同肿瘤中LINC02321可能通过影响不同类型免疫细胞的浸润进而参与特定免疫微环境的形成。最后,本研究通过qRT-PCR验证了LINC02321在UCEC组织中的上调表达,后续可进一步对UCEC患者血清和血浆样本中LINC02321的表达及其临床相关性和临床意义进行研究,为临床应用转化提供理论依据。

综上所述,本研究基于公共数据通过生物信息学分析揭示了lncRNA LINC02321在UCEC中异常高表达且可作为潜在的UCEC诊断、预后判断的生物标志物以及免疫治疗靶点,同时为进一步开展LINC02321的基础与临床转化研究奠定基础。