盛晓丹 郭卉 秦春芝 刘霞 黄迪海 徐怀英 秦桌明
摘 要：为确诊山东某商品肉鸡群发病的原因，采集病死鸡的喉头、气管等组织，分别进行核酸和病原分离鉴定。结果显示，传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和禽腺病毒4型（FAdV-4）等特异性PCR均呈阳性，而新城疫病毒（NDV）、低致病性禽流感H9N2等均为阴性。测序结果表明，ILTV分离株（PY）与疫苗株（K317）ICP4基因的核苷酸同源性为100%;而IBV分离株（PY）与疫苗株H120、4/91N基因的同源性分别为86.4%、86.6%，显示出较大的差异。CAM途径接种鸡胚分离出腺病毒，且对SPF鸡胚具有一定的致病性。同时，从病鸡肝脏中分离到大肠杆菌，药敏试验证实对多粘菌素B、健牧茶多酚、阿莫西林棒酸、头孢噻肟敏感，采用敏感药物治疗后取得一定的临床治疗效果。综上所述，该病是一起由疫苗接种应激而引起的多病原混合感染。
关键词：传染性喉气管炎病毒;禽腺病毒4型;传染性支气管炎病毒;大肠杆菌;混合感染
中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2021）11-0039-06
2021年4月于山东某商品肉鸡场发现一起严重呼吸道症状的病例。该场肉鸡于7日龄免疫新支二联活疫苗（La Sota株+H120株），19日龄采用点眼方式接种传染性喉气管炎活疫苗（K317株），免疫2 d后出现呼噜声、咳嗽，严重者有引颈呼吸等呼吸困难的症状，并迅速波及全群，死淘率逐日攀升，多种药物治疗效果不佳。临床剖检发现喉头、气管粘膜出血严重，气管内有大量的红色粘液，细支气管内有黄色栓塞物，个别鸡出现心包炎、气囊炎、心包积液增多的症状，疑似病毒和细菌混合感染。笔者采集死亡鸡只的气管、肺、喉头、肝脏等组织样品进行病毒的PCR鉴定及细菌分离与药敏试验，确认肉鸡发病及死亡原因，为此次病情的预防控制和科学用药提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、材料和仪器
Simply P病毒DNA/RNA共提取试剂盒，购自杭州博日科技有限公司;DNA回收试剂盒，购自天根生物科技有限公司;Reverse Transcriptase M-MLV、TaKaRa Taq HS Perfect Mix、DL2000 bp DNA Marker，购自宝生物（北京）有限公司;药敏片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司;健牧茶多酚药敏纸片，自制（200 μg/片）;10日龄SPF鸡胚，由山东省农业科学院家禽研究所提供;PCR仪（TC-XP型），购自杭州博日科技有限公司。
1.2 引物的设计与合成
参照GenBank中FAdV-4、ILTV、IBV、新城疫（NDV）和H9亚型AIV的经典序列，应用Primer Premier 5. 0软件设计合成特异性引物，由北京六合华大基因有限公司合成。病毒检测引物见表1。
1.3 病料处理
剖检具有典型症状的发病鸡或死亡鸡，取其气管或刮取粘液、肺、脾脏作为病料，剪碎、匀浆，反复冻融3次后，1 2000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃保存备用。将可疑病料命名为PY。
1.4 病毒核酸提取
按照Simply P病毒DNA/RNA共提取试剂盒说明书提取上清液中的RNA和DNA。
1.5 IBV、AIV H9、NDV反转录
取经DNaseⅠ处理过的1 μg总RNA为模板，加Random Primer（0.5 μg/μL）1 μL，按照Reverse Transcriptase M-MLV试剂说明书进行反转录，获得cDNA作为PCR反应模板。
1.6 病毒核酸PCR鉴定
以cDNA和提取的总DNA为模板，采用表1的引物分别进行PCR扩增。
PCR反应体系25 μL：2×TaKaRa Taq HS Perfect Mix 12. 5 μL、上下游引物（10 μmol/L） 各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 9. 5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 个循环;72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存备用。取10 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪中观察并记录结果，回收目的条带进行测序。利用Lasergen 7.1和MEGA 5软件对测序结果进行同源性比较与进化树分析。
1.7 病毒分离
取1.3中制备的病料上清，利用0.22 μm过滤器除菌，分别接种10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和尿囊腔，弃24 h内非特异性死亡的鸡胚，37 ℃培养96 h，分别无菌收集尿囊液和CAM，盲传3代，观察鸡胚病变，提取CAM的DNA样本和尿囊液的RNA样本进行核酸检测。
1.8 细菌分离与药敏试验
1.8.1 细菌分离 无菌操作采集肝脏组织样品，划线接种血液琼脂培养基，于37 ℃培养24 h，挑取灰白色菌落接种于麦康凯培养基，37 ℃培养24 h后挑取粉红色菌落，进行鉴定及药敏试验。
1.8.2 16S rDNA分子鉴定 取新鲜制备的分离纯化菌液适量，根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA为模板，以细菌16S rRNA通用引物为特异性引物进行扩增，PCR反应体系25 μL：2×TaKaRa Taq HS Perfect Mix 12. 5μL、通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）各0.5 μL、DNA 1 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 个循环;72 ℃延伸10 min，于4℃保存备用。取10 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪中观察并进行测序。测序结果与参考菌株进行核苷酸同源性比对。
1.8.3 药敏试验 采用Kirby-bauer琼脂扩散法对分离菌株进行常用抗生素的敏感性试验，测定抑菌圈直径，并参考美国临床和实验室标准协会（ 2013年）的标准判定其耐药情况。
2 结果
2.1 病毒核酸检测
对病鸡的气管粘液检测显示，FAdV-4分离株（PY）的片段长度为885 bp;ILTV分离株（PY）的 ICP4基因片段为574 bp;IBV分离株（PY）的N基因片段长度为830 bp;以上均与FAdV、ILTV和IBV的标准阳性对照片段大小相符。但对NDV和H9N2亚型禽流感病毒的核酸检测阴性（图1）。
2.2 ILTV和IBV序列同源性分析
利用MegAlign生物信息学软件进行序列同源性比较。结果显示，ILTV PY分离株与疫苗株K317株（GenBank 登录号：JX458824）ICP4基因序列的核苷酸同源性为100%，推测ILTV PY可能为疫苗株;IBV PY分离株（PY01.2021）与中国IBV近期流行株QX株的N基因核苷酸同源性高达93.4%，显示出较高的同源性，而与国内常用的疫苗株H120和4/91同源性仅为86.4%、86.6%，显示出较大的遗传距离（图2、图3）。
2.3 病原分离
病料上清无菌处理后，经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚，120 h内未出现鸡胚死亡，且盲传3代仍未发现鸡胚死亡。解剖第3代感染鸡胚和未感染鸡胚发现：感染鸡胚发育不良，注射部位鸡胚CAM增厚，形成边缘凸起、中间凹陷的灰白色痘斑，而对照组鸡胚发育正常。收集第3代CAM，提取病毒DNA进行PCR扩增，结果显示ILTV和FAdV-4均为核酸阳性，与病料检测结果一致。表明ILTV和FAdV-4感染SPF鸡胚能导致鸡胚发育异常，但对鸡胚不致死。
病料上清无菌处理后经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，连续三代感染120 h内未出现鸡胚死亡，但感染鸡胚发育不良。收集第3代感染36 h的鸡胚尿囊液，提取病毒RNA进行RT-PCR扩增，结果显示IBV为阳性，与病料检测结果一致。
2.4 细菌分离培养与鉴定
分离株在麦康凯培养基上呈圆形、光滑的粉红色菌落，经革兰氏染色后在油镜下观察到两端钝圆的红色短杆菌，为革兰氏阴性菌，疑为大肠杆菌。
分离株16S rRNA扩增条带大小为1 500 bp左右。该片段测序后与Genbank已有序列进行同源性比对，发现分离菌株与大肠杆菌Escherichia coli strain AH01（CP055251） 的16S rRNA核苷酸同源性较高，为98%，因此鉴定该分离菌为大肠杆菌。
2.5 分离菌耐药性检测
由表2可见，分离菌仅对多粘菌素B、头孢曲松、头孢噻肟、健牧茶多酚敏感，对阿莫西林棒酸中度敏感，对氨苄西林、阿奇霉素、多西环素、林可霉素、氟苯尼考、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等多数药物耐药。
3 讨论
本试验先后从山东某商品肉鸡场的病死鸡气管中检测到ILTV、FAdV-4和IBV，经测序后确诊为ILTV、FAdV-4和IBV。进一步比较发现，ILTV片段核酸测序结果与疫苗免疫所用的疫苗株K317的ICP4基因核苷酸同源性为100%，结合该鸡场近期曾经免疫过ILTV弱毒疫苗，因此推断此次疫情是一起由不合理的疫苗使用而引起的多病原混合感染和继发感染。应引起养殖企业的高度重视。建议养殖企业，在ILTV疫苗免疫前需对需要免疫的鸡群进行风险评估，同时做好其他病原的综合防控工作，防止继发感染 [1]。
免疫接种是目前预防传染性喉炎最有效的途径。ILTV疫苗主要包括鸡胚源疫苗（CEO）、细胞源疫苗（TCO）和基因工程疫苗等三大类型。其中，CEO疫苗最为常用，占我国成年鸡ILTV活疫苗使用量的70%以上。其优点是：使用方便，适合于滴眼、饮水或喷雾等多种途径免疫，每种方法均能够提供较好的群体免疫效果。缺点是：对1月龄以内的雏鸡具有致病性，仅适用于4周龄以上的育成鸡或成年鸡[2]，对雏鸡存在一定的安全隐患。此次疫病发生就是一个例证。相反，基因工程疫苗在商品肉鸡免疫方面则具有较大潜力。王云峰等（2001）利用FPV为载体，成功表达ILTV中国王岗株gB基因，通过对1日龄鸡接种试验表明，该重组病毒无论对商品鸡还是SPF鸡的免疫保护均为100%，该疫苗已于2005年获得国家新兽药注册证书[3-5]。在美国，有两个已批准的商业重组ILTV疫苗：一是由CEVA生产（Biomune公司），该疫苗利用FPV作为载体插入ILTV的gB和UL32基因;二是由Intervet公司生产，是将ILTV的gI和gD基因克隆到火鸡疱疹病毒基因中。上述疫苗均适合于胚胎接种或1日龄雏鸡接种。总之，对于已发生过或周边发生过疫情的规模化肉鸡场，建议可接种1日龄雏鸡，能有效预防ILT的发生而减少危害[6]。因ILTV是DNA病毒，在环境中的存活能力较强，应延长鸡舍空栏期的时间，并采取醛类、含氯消毒剂等进行交叉反复消毒[7]。
本试验从气管中检测到的IBV分离株，与IBV流行株 QX株，其N基因部分序列同源性较高，而与该养殖场近期免疫的H120株和4/91株同源性仅为85.7%和87.2%，因此推断该IBV分离株可能为野毒株，而非疫苗株。QX型IBV目前仍是山东地区流行的主要毒株，但多数养殖场免疫H120、4/91株，对QX型强毒株感染的保护率较低，而QXL87疫苗株对部分QX型强毒株感染的保护率仅达到80%，达不到100%。因此，养殖企业应尽量选择与当地流行毒株的血清型一致的疫苗株免疫才能发挥有效的保护作用[8]。
由于传染性喉气管炎无特效治疗药物，应快速淘汰病死鸡，对其他健康鸡群饮用抗病毒中药、转移因子等对症治疗，以提高鸡群的抵抗力。同时，根据药敏试验结果在饲料中添加健牧茶多酚，并与阿莫西林棒酸饮水配伍连用5 d治疗大肠杆菌感染。结果，发病鸡群采食逐渐恢复正常，死淘率下降，7 d后该养殖场病情得到有效控制。
4 结论
此次发病为ILTV、FAdV-4、IBV和大肠杆菌混合感染，免疫ILTV活疫苗可能是造成此次疫情的诱因。
参考文献：
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