陈淑圻，李悦山
广州医学院药理教研室，广东广州 510182
他汀类药自20世纪70年代问世以来，在降脂治疗中起了重大的作用。至今市场已出现8种他汀类药物，分别是洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀、匹伐他汀和2001年退市的西立伐他汀[1]。洛伐他汀因能显着降低胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，具有良好的降血脂作用而较广泛地被用于临床。
有相关报道[2-4]显示，目前洛伐他汀在临床应用的主要剂型有：普通片剂、胶囊剂、颗粒剂，缓释片、分散片和滴丸。由于洛伐他汀难溶于水，其普通片剂服药次数多，服用不方便，血药浓度起伏大，生物利用度低，不利于临床用药的安全性[5]。为了提高药物的生物利用度，减少不良反应的发生率，并解决普通缓释片不易分割的问题，研制洛伐他汀微丸型片剂具有重要的意义。本文进行了洛伐他汀缓释微丸型片剂新剂型的处方前研究，为进一步研究工作打下基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器
KQ-400型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司），高效液相色谱仪（Agilent 1200），电子天平（BA110S，Sartorius），Hp-8452A型紫外-可见分光光度计（HEWLETT PACKARD），PHS-25型pH计（上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），THZ-82水浴恒温振荡器 （江苏省金坛市宏华仪器厂），SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。
1.2 材料
洛伐他汀（陕西森弗生物技术有限公司），磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠、盐酸、磷酸二氢钙、正辛醇、磷酸、乙醇（分析纯，广州化学试剂厂），甲醇、乙腈（色谱纯，依能色谱有限公司），微晶纤维素 PH101、HPMC E5（湖州展望药业有限公司），羧甲基淀粉钠（法国罗盖特），Eudragit NE 30D（德国罗姆公司），滑石粉Talc（1 000目）（中美合资广西龙胜华美滑石开发有限公司），磷酸二氢钙（分析纯，广州化学试剂厂），硬脂酸（上海倍特化工有限公司），硬脂酸镁、乳糖（上海运宏化工制剂辅料技术有限公司）。
2 方法与结果
2.1 洛伐他汀溶解度的测定
2.1.1 吸收波长的选择
洛伐他汀为水难溶性药物，根据文献报道[6]，其在甲醇、十二烷基硫酸钠（SDS）等溶液中有一定的溶解度。分别测定洛伐他汀在0.1 mol/L HCl、水、甲醇、乙醇、0.5%SDS和pH=6.8磷酸盐缓冲液（内含0.5%SDS，下同）溶液中的溶解度。以相应溶剂作为空白对照，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，测定最大吸收波长。由扫描结果可知，洛伐他汀在上述介质中的最大吸收波长均为238 nm。
2.1.2 测定洛伐他汀在不同介质中的溶解度
称取六份适量的洛伐他汀，分别置于25 ml具塞锥形瓶中，分别加入 0.1 mol/L HCl、水、甲醇、乙醇、0.5%SDS和 pH=6.8磷酸盐缓冲液各20 ml，将锥形瓶置于恒温振荡器中振荡，温度为（37±1）℃，100 r/min 振荡 24 h 后取样，用 0.45 μm的微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液经适当稀释后，按紫外分光光度法分别在238 nm处测定吸收度，计算药物在各种介质中的溶解度，见表1。
表1 洛伐他汀在不同介质中的溶解度[（37±1）℃]
2.2 油水分配系数的测定
用不同pH的缓冲液配制适宜浓度的洛伐他汀溶液，取该溶液10 ml与正辛醇10 ml混合，置于锥形瓶中。（25±1）℃，100 r/min恒温振荡24 h，离心分离两相，取水相经适当稀释后，按紫外分光光度法分别在238 nm处测定吸收度，计算平衡前后水相中的药物浓度，计算表观油水分配系数。绘制洛伐他汀表观油水分配系数与溶出介质pH的关系图。见图1。
由结果可知，当pH在1.0～6.8之间时，洛伐他汀的Papp值较小；当pH＞7.0时，Papp值随着pH增大而急剧上升，表明药物随着pH的增大水溶性逐步降低，在碱性环境下，亲脂性大大增强。
2.3 体外分析方法的建立
2.3.1 含量测定方法
2.3.1.1 色谱条件 参考《美国药典》（30版）中洛伐他汀片含量测定的方法，具体色谱条件为：①缓冲液：取3.45 g磷酸二氢钠溶于900ml水中，加磷酸调pH值至4.0，加水稀释至1000ml。②流动相：乙腈∶缓冲液∶甲醇=5∶3∶1。③柱温：45℃。④色谱柱：C18柱[7]，柱型号为 Dionexacclaim120C18（4.6mm×150mm，5 μm）。⑤测定波长：238 nm。 ⑥流速：1 ml/min。 ⑦进样量：10 μl。 制备每1 ml中约含洛伐他汀10 μg的溶液，作为对照品溶液；取样品按通用方法制备供试品溶液；取辅料按同样方法制备空白辅料溶液。将上述样品分别进样，结果表明洛伐他汀甲醇溶液在波长为238 nm时，出峰时间为10 min左右，且所用辅料在保留时间处无干扰。
2.3.1.2 标准曲线 精密称取洛伐他汀对照品20 mg置于100 ml容量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，加甲醇定容至刻度。精密移取对照品母液 0.1、0.4、0.8、1.6、3.2 ml置于 10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀即得。分别按“2.3.1.1”色谱条件操作，记录色谱图。以浓度（C）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得到线性方程为：A=29 567C+9 095.7（r=0.999 9）。 结果，洛伐他汀在 1.98～63.52 μg/ml范围内线性关系良好。
2.3.1.3 回收率 精密称取洛伐他汀及模拟缓释微丸片处方比例的适量辅料，加入甲醇配制成10、30、60 μg/ml的样品溶液各3份。高效液相色谱法测定其峰面积，根据标准曲线计算含量，以测得量与加入量比较，计算回收率。由表2的数据可以看出，各浓度回收率均接近100%，平均RSD均小于2%，说明该方法准确度良好。
表2 洛伐他汀含量回收率
2.3.1.4 样品溶液稳定性试验 将上述绘制标准曲线的第3号溶液（15.88 μg/ml），避光放置 12 h，分别于 0、3、6、9、12 h 测定峰面积，本品在12 h内稳定。RSD为0.04%。
2.3.1.5 精密度测定 称取洛伐他汀适量，分别配制浓度为10、30、60 μg/ml的样品甲醇溶液，按高效液相测定法测定，每个样品平行测3次，记录色谱图，测定结果见表3。
表3 洛伐他汀含量精密度
2.3.1.6含量测定方法 取缓释微丸片10片，精密称定，研细。精密称取细粉适量（约相当于洛伐他汀40 mg），置于50 ml容量瓶中，加适量甲醇，超声15 min，放冷后加甲醇稀释至刻度。摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1 ml至10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。用上述的高效液相方法测定溶液在238 nm波长的峰面积，与对照品的峰面积对照，按外标一点法计算样品含量。
2.3.2 释放度测定方法
根据洛伐他汀的溶解特性，本缓释片制成12 h缓释释药较合适，按照《中国药典》（2005年版）缓控释制剂指导原则，累计百分释放度应满足：2 h约30%、6 h约50%、12 h＞80%。
2.3.2.1 释放介质的选择 按照《中国药典》（2005年版）附录XIX D缓控释制剂指导原则，释放介质以去空气的新鲜纯水为最佳，或根据药物的溶解特性、处方要求、吸收部位，使用稀盐酸（0.001～0.1 mol/L）或 pH 为 3～8的磷酸盐缓冲液，对难溶性药物不宜采用有机溶剂，可加少量表面活性剂（如十二烷基硫酸钠等）。由“2.1.2”项下测定结果可知，洛伐他汀在水中溶解度极小，只有0.7 μg/ml左右，以水为释放介质达不到漏槽条件，而用人工胃液（0.1 mol/L HCl）和人工肠液（pH=6.8磷酸盐缓冲液）作释放介质可达到漏槽条件。
2.3.2.2 释放度测定方法 参照《中国药典》（2005年版）二部附录溶出度测定第一法转篮法装置，释放前2 h以0.1 mol/L HCl模拟人工胃液为释放介质900 ml，2 h之后以pH=6.8磷酸盐缓冲液900 ml为释放介质，转速100 r/min，温度（37.0±0.5）℃，依法操作，定时取样5 ml（同时补加等量同温释放介质），过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液进高效液相，测定溶液峰面积，计算药物不同时间点的累积释放率。
2.3.2.3 释放度数据分析方法 体外释放度试验是筛选缓控释制剂处方和控制其质量的重要手段。国外学者在比较两种制剂的释放度曲线时，常带入适宜的数学模型加以评价。f2方程[8-9]为美国FDA推荐，用以比较两条释放曲线等价性的方法[10]，该方法的优点在于可直接对释药数据进行统计分析，无需拟合各种释药速率。其公式为：
Rt为参比样品t时释放度；Tt为试验样品t时释放度。完全相同的两条释放曲线，其f2=100；释放差异增大，f2值减小；f2＞50，均认为有相同的释放行为。
3 讨论
3.1 药物的溶解度
药物的溶解度直接影响药物的吸收与药物在体内的生物利用度，是制备药物制剂首先应掌握的信息。通过测定药物溶解度，表明洛伐他汀在水中不溶，在甲醇、乙醇中有较好的溶解性，加入表面活性剂十二烷基硫酸钠可增加药物的水溶性，药物在0.1 mol/L HCl溶液和pH=6.8的磷酸缓冲液中有一定的溶解性，用作释放介质均能达到漏槽条件。
3.2 药物的油水分配系数
药物要进入体内，必须要穿过细胞的生物膜。由于细胞膜具有脂质和蛋白质，因此药物的亲脂性程度与药物的油/水分配系数有关。油水分配系数试验表明洛伐他汀在pH为1.0～6.8的介质中表观油水分配系数较小，但当pH＞7时表观油水分配系数急剧增大，表观油水分配系数过大将使药物蓄积于生物膜，难以进入体循环，所以将洛伐他汀制备成12 h释药较宜。
3.3 含量测定方法
本文采用高效液相色谱法测定样品含量，流动相参考《美国药典》（30 版）使用乙腈∶磷酸缓冲液∶甲醇=5∶3∶1，柱温45℃，经试验药物于10 min左右出峰。经方法学验证，线性范围良好，回收率好，日内精密度平均RSD＜2%，方法准确可靠。
3.4 释放度测定方法
由于释放介质不宜用有机溶剂，从溶解度试验可知，药物在0.1 mol/L HCl溶液和pH=6.8的磷酸缓冲液中有一定的溶解度，作为释放介质可达到漏槽条件，且药物在介质中稳定。释放度数据分析方法采用美国FDA推荐的f2方程进行评价。
[1]叶红梅,熊学文.他汀类药物临床研究进展[J].中国药师,2009,12(2)：176-179.
[2]陆裕德,苏博,白菊民.洛伐他汀缓释片的制备及体内外评价[J].中国医药工业杂志.2006,37(5)：329-331.
[3]王伟,陈文展.洛伐他汀分散片及其制备方法[P].中国专利：101444493,2009-06-03.
[4]李永强,郑永锋.一种含洛伐他汀的滴丸及其制备方法[P].中国专利：101194893,2008-06-11.
[5]Langtry HD,Spencer CM.Lovasattin coat-Core a review of pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and clinical efficacy[J].Drugs,1997,53(5)：867-884.
[6]丙耀诚.现代药物学[M].北京：人民军医出版社,1999：165.
[7]高燕霞,姜建国,张西如.HPLC法测定洛伐他汀胶囊的溶出度[J].中国抗生素杂志,2009,34(11)：678-681.
[8]Moore JW,Flanner HH.Mathematical comparison of dissolution profiles[J].Pharm Tech,1996,6：64-74.
[9]Peh KK,Wong CF.Application of similarity factor in development of controlled-release diltiazem tablet[J].Drug Dev and Ind Pharm,2000,26(7)：723-730.
[10]宗莉,王柏,张宁.双氯酚酸钾缓释片的研制及释药特性的探讨[J].中国药科大学学报,2001,32(3)：206-209.
