刘文伟 张雪燕 习 静 韩跃武
兰州大学基础医学院生化教研所，甘肃兰州 730000
诊断慢性粒细胞白血病的电化学生物传感器的研究
刘文伟 张雪燕 习 静 韩跃武
兰州大学基础医学院生化教研所，甘肃兰州 730000
目的 建立一种检测慢性粒细胞白血病的方法。 方法 此实验在已经筛选出慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞5个特异性、结合率较高的核酸适体的基础上，构建了一种检测方法：采用两种纳米金属材料分别标记5个适体，将标记后的10个适体，两两组合与CML K562同时结合，一个作为捕获分子，一个作为测定分子与CML K562结合后，经氧化还原反应将测定分子上的金属转化成离子状态，利用电化学工作站检测对应的电流。 结果 筛选出了最佳组合（P2-S3-P1-S5）实现对CML K562的检测，得到了检测细胞数目与DPV电流值的拟合曲线方程。 结论 得到一种检测下限可达到50个细胞的诊断慢性粒细胞白血病的电化学生物传感器。
核酸适体；纳米材料；CML K562；电化学生物传感器
目前以适体作为识别元件的生物传感器有光学适体生物传感器、电化学生物传感器、压电石英晶体生物传感器[1-4]。SELEX技术自问世已有20多年的发展历程，光学适体生物传感器和压电石英晶体生物传感器已相继有商品，但适体电化学传感器的研究还处于起步阶段，其中早期诊断慢性粒细胞白血病（CML）的电化学生物传感器也是一个空缺。笔者采用两种纳米材料分别标记5个适体，两两组合，一个作为捕获分子，一个作为测定分子与CML K562结合后，经氧化还原反应将测定分子上的金属转化成离子状态，利用电化学工作站检测电流[5-10]，筛选出最佳组合，结合适体与CML K562的结合率，可以判断结合的CML K562的数量，得到一种操作简单、灵敏度高、快速的早期诊断慢性粒细胞白血病的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
CHI1210A电化学分析仪（CHI公司，美国）、原子吸收分光光度计、德国耶拿原子吸收光谱仪，型号ZEEnit700。
质粒抽提、PCR等试剂盒、100 bp DNA marker、胎牛血清（上海生工生物技术有限公司）生物素-链霉亲合素磁珠及磁力架、8种引物（上海生工生物技术有限公司）分别为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8：带羧基磁性纳米颗粒（平均粒径为30 nm）（巴溪仪器有限公司）；四氯金酸溶液（HAuCl4，上海中秦化学试剂有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 用氨基标记核酸适体 S1、S2、S3、S4、S5
根据ssDNA适体的序列选择各适体需要的上、下游引物经PCR扩增成5'端标记氨基和生物素的双链DNA。用生物素-链霉亲和素磁珠的方法分离，获得5'端标记氨基适体[4]。
1.2.2 用巯基标记核酸适体 S1、S2、S3、S4、S5
根据ssDNA适体的序列选择各适体上、下游引物经PCR扩增成5'端标记巯基和生物素的双链DNA。用生物素-链霉亲和素磁珠的方法分离，获得5'端标记巯基适体。
1.2.3 在磁性纳米粒子上固定标记氨基的核酸适体Ⅰ
将50 μL的带羧基的磁性纳米粒子用PBS缓冲溶液（pH=7.3）洗涤 5 次（500 μL/次）、5'端标记氨基的核酸适体40 μL，加入5 mg咪唑，超声 30 min，室温下放置 12 h。 利用磁铁分离，分3次用600 μL PBS溶液洗涤沉淀，洗去过量的核酸适配体Ⅰ，将最终的沉淀（纳米粒子上固定有核酸适体Ⅰ）分散在 500 μL PBS 缓冲溶液中，4℃冷藏[11]。
1.2.4 巯基标记核酸适体Ⅱ金胶探针的制备
1.2.4.1 金胶溶液的制备 参照文献[2]制备金胶溶液：所用器皿均用王水浸泡过夜，用三蒸水冲洗。将HAuCl4配制成0.01%水溶液，将1.1 mg HAuCl4溶于11 mL三蒸水，过0.22 μm的滤膜。将柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）配制成1%水溶液，将0.1 g柠檬酸三钠溶于10 mL三蒸水，过0.22 μm的滤膜。取10 mL 0.01%HAuCl4煮沸，边搅动边准确加入250 μL的1%柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。在沸腾状态搅拌15～30 min。不加热情况下再搅拌10 min。冷却至室温，用蒸馏水定容至原体积。置于棕色瓶内4℃保存，数月有效[12]。
1.2.4.2 巯基标记核酸适体Ⅱ金胶探针制备结合比例的确定用3 mL的金胶溶液溶解30、40、50 μL的巯基标记核酸适体Ⅱ，室温静置24 h，让核酸适配体Ⅱ中的巯基与金胶充分结合，然后将此溶液在15 000 r/min条件下，离心25 min，分离后收集上清液。用500 μL 0.1 mol/L PBS缓冲溶液（pH=7.3）冲洗沉淀物3次，反复离心，收集上清液（除去过量的核酸适体），合并上清液，在260 nm处测定吸光度（图1）。
由图1可知，用40、50 μL含巯基的核酸适体与3 mL金胶溶液制备的金胶探针，在260 nm处有吸光度、用30 μL含巯基的核酸适体与3 mL金胶溶液制备的金胶探针，在260 nm处无明显吸光度，说明40 μL以上比例的巯基标记核酸适体溶解于3 mL的金胶溶液制备金胶探针时，可确保巯基标记核酸适体Ⅱ过量。
1.2.4.3 巯基标记核酸适体Ⅱ金胶探针的制备 用3 mL的金胶溶液溶解40 μL的巯基标记核酸适体Ⅱ用上述方法制备金胶探针，将离心后的沉淀，加入500 μL 0.1 mol/L PBS缓冲溶液（pH=7.3）稀释成一定浓度，4℃低温冷藏。
1.2.5 CMLK562的特异性识别与分离
用含10%小牛血清的RPMI-1640的培养液，培养细胞。调整细胞计数浓度为5×105/mL左右，20 pmoL的纳米粒子上固定有核酸适体Ⅰ悬浮液[9]，将 10 μL 的 PBS（1.5 mmol/L，pH=7.4）溶液和20 pmoL核酸适体Ⅱ的金胶探针置于自制的反应池中，加入20 μL的K562细胞溶液，在室温下识别结合20 min。K562细胞与核酸适配体Ⅰ和Ⅱ特异性结合形成含有磁性颗粒和纳米金的复合结构结构。然后，把电极放在一块磁铁上，将上述液体滴加在工作电极上，待三明治结构吸附在工作电极后，1～2 min，吸弃溶液，在磁场作用下，用PBS缓冲溶液冲洗几次，分离沉淀，除去未结合的多余的适体或细胞液[14]。最后含复合结构的磁性颗粒吸附在电极表面待测定电流。
1.2.6 检测电化学
1.2.6.1 两种纳米粒子标记的核酸适体两两组合后最佳配对的筛选 将吸有复合结构的磁性颗粒的电极放于磁铁，将0.1 mol/L盐酸溶液20 μL滴加在工作电极上，注意液滴覆盖工作电极、参比电极和辅助电极。用+1.25 V恒电位预氧化150 s，使金胶探针中的金原子氧化成Au3+离子，立即进行反向阴极扫描，获得Au3+电化学还原的差分脉冲伏安（DPSV）曲线[15]。从此图可知金胶探针的特征电化学还原峰在+0.45 V（vs.Ag/AgCl），有两组适体的配对产生的电流非常明显，证明此组为最佳组合（P2-S3-P1-S5）。
1.2.6.2 适体检测方法灵敏度及检测限的测定 将筛选出的最佳组合的适体组（P2-S3-P1-S5），分别取20 pmoL按照上述实验方法1.2.5和1.2.6，分别检测不同数量的K562细胞。见图2。
图2以细胞数目为横坐标，DPV电流值为纵坐标，利用SigmaPlot 10.0软件做非线性回归分析结果，拟合曲线方程为：Y=-0.205X/（62.73+X）， 其中 X 为细胞数目，Y 为 DPV电流值。如图2所示，对慢性粒细胞白血病K562细胞的最低检测限是50个细胞。随着细胞数目的增加，DPV电流值增加，随后待适体均被结合以后基本到达一个平台，不再随着细胞数目的增加而增加。对样品重复测定10次，测得相对标准偏差RSD为3.78%。
2 结果
本文建立了一种用两种金属元素标记核酸适体，然后让两种标志物的核酸适体分别或两两组合后同时与靶物质慢性粒细胞白血病K562细胞结合分离后，分别测定金属含量并比较前后变化，判断出两个核酸适体与靶物质结合的结合位点不同。然后用纳米金为电化学活性物质，筛选出最佳组合（P2-S3-P1-S5），制备了早期诊断慢性粒细胞白血病的电化学生物传感器。此种方法操作简单，检测灵敏度高，即使细胞数目为50个也能检测出。
3 讨论
慢性粒细胞白血病是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤。主要的诊断方法有血象、骨髓象、中性粒细胞碱性磷酸酶检测（NAP）、细胞遗传学检测、分子遗传学检测等。然而，目前的分子诊断技术要求高，灵敏度不高，还无法在肿瘤发生的早期进行诊断，所以白血病的早期诊断是个亟待解决的问题。
随着慢粒早期诊断研究的不断深入，结合核酸适配子的特性，本实验在研究了大量的核酸适体、核酸适体生物传感器、核酸适体电化学生物传感器相关报道的基础上，结合本实验室已经筛选出的5个结合率高于40%的慢性粒细胞白血病适体，利用核酸适体易于标记的特点，结和胶体金技术，磁性纳米粒子两种纳米材料、电化学检测技术，用带羧基的磁性纳米粒子的已经标记有氨基的5个ssDNA核酸适配子和胶体金标记了巯基的5个ssDNA核酸适配子两两组合的适体，一个作为捕获分子，一个作为测定分子与CML K562结合后，利用磁铁将结合物固定在三电极系统分别为：玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝网辅助电极的丝网印刷电极传感器，经氧化还原反应将电极上的金原子转化成离子状态，利用电化学工作站检测对应的电流，筛选出最佳组合。利用最佳组合适体对与不同数量的CML K562结合，通过检测到的电流与CML K562的数量关系式，利用软件做非线性回归分析结果得到拟合曲线方程：Y=－0.205X/（62.73+X），其中X为细胞数目，Y为DPV电流值。对慢性粒细胞白血病K562细胞的最低检测限可达到50个细胞。随着细胞数目的增加，DPV电流值增加，随后待适体均被结合以后基本到达一个平台，不再随着细胞数目的增加而增加。对样品重复测定10次，测得相对标准偏差RSD为3.78%，从而得到一种操作简单、灵敏度高、快速的早期诊断慢性粒细胞白血病的方法。
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Study of electrochemical biosensor for diagnosis chronic myeloid leukemia
LIU WenweiZHANG Xueyan XI JingHAN Yuewu
Research Institute of Biochemistry,School of Basic Medical Science,Lanzhou University,Gansu Province,Lanzhou 730000,China
Objective To creat a method of detection for chronic myelocytic leukemia.Methods A method of detection had been built,based on an experiment in lab,during which,5 highly-combined aptamers of CML K562 cells had been selected.Five aptamers were marked with two kinds of nanoparticles separately.The ten marked aptamers were divided into 20 pairs by every two combination.In every pair,the aptamers,one as the capture molecules,the other the determination molecules,were combined with CML K562 cells.Then the Au atoms were transformed into the state of Au-ion by REDOX reactions and electric current was sensed by electrochemical detection.Results The best pair of aptamers was selected to detecte CML K562,the fitted curve equation to test cells number and DPV of current value was obtained.Conclusion Get a electrochemical biosensor which can be used to diagnose CML K562 cells,with a detection limit up to 50 cells.
Aptamers;Nanoparticles;CML K562;Electrochemical biosensor
R557
A
1673-7210（2012）08（b）-0014-03
2012-03-14 本文编辑：张瑜杰）
