李 锐 龚莉琼 田素飞
1.怀化医专附属怀化市第三人民医院检验科，湖南怀化 418000；2.中国医科大学附属第一医院检验科，辽宁沈阳 110001
非发酵菌是指一群不发酵糖类或仅以氧化形式利用葡萄糖、需氧或兼性厌氧的无芽胞革兰阴性杆菌，包括不动杆菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德菌属等在内的9个属近百种细菌。近年来，由于各种广谱抗菌药物、化学治疗、放射治疗、侵袭性操作的开展及免疫抑制剂的应用，使非发酵菌已成为机会感染与医院感染的主要致病菌，尤其是铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。并且这些菌株往往表现为多重耐药，给临床治疗造成了极大的困难。产β-内酰胺酶（ESBLs）是革兰阴性杆菌最重要的耐药机制，其中以产ESBLs和碳青霉烯酶最具有临床意义。本研究对2011年6月～2012年6月怀化市第三人民医院156株非发酵菌进行耐药性及产ESBLs和碳青霉烯酶分析，旨在为临床合理使用抗菌药物、降低医院感染发生率、预防和控制非发酵菌感染提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
收集怀化市第三人民医院2011年6月～2012年6月各临床科室送检的微生物标本中分离的非发酵菌156株，同一患者无重复标本。
1.2 主要试剂与仪器
美罗培南（MEM）、亚胺培南（IPM）、哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TZ）、 头孢吡肟 （FEP）、 头孢他啶 （CAZ）、 头孢噻肟（CTX）、头孢哌酮/舒巴坦（CFP/SU）、阿米卡星（AK）、环丙沙星（CIP）、氨曲南（ATM）、庆大霉素（GM）、妥布霉素（TPM）、复方新诺明（SXT）、氨苄西林（AMP）、左旋氧氟沙星（LEV）、头孢噻肟/棒酸（CD03，30/10 μg）、头孢他啶/棒酸（CD02，30/10μg），均为英国OXO ID公司产品；M-H培养基干粉，由杭州天和微生物试剂有限公司提供；VITEK-2全自动微生物分析仪及与其配套的GN革兰阴性杆菌鉴定卡和YST GN13药敏试验卡，由法国生物梅里埃公司提供。
1.3 质控菌株
大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯ATCC 700603、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706，均购自卫生部临床检验中心。
1.4 细菌的分离培养、鉴定
按《全国临床检验操作规程》（第3版）进行细菌的分离培养和常规鉴定，采用Vitek-2微生物分析系统进行鉴定。
1.5 药物敏感性试验
根据美国临床实验室标准化委员会（CLSL/NCCLS 2010版）标准采用纸片扩散法（K-B法）检测常见非发酵菌对15种抗生素（IPM、MEM、PIP/TZ、FEP、CAZ）、CTX、CFP/SU、AK、CIP、ATM、GM、TPM、SXT、AMP、LEV）的耐药性。 将大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853作为药敏试验质控菌株。结果判断参照NCCLS 2010年判断标准。
1.6 β-内酰胺酶检测
初筛试验（CAZ≤22 mm，CTX ≤27 mm，ATM ≤27 mm，FEP≤22 mm）为阳性的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌按NCCLS确认试验检测 （纸片增效试验），即CTX （30μg），CTX/CLV （CD03，30/10 μg） 与 CAZ （30 μg），CAZ/CLV（CD02，30/10μg），任意一对含酶抑制剂纸片抑菌圈直径增加≥5 mm为ESBLs阳性。具体步骤参照《全国临床检验操作规程》（第3版）。质控菌株选用ESBLs阳性的肺炎克雷伯菌ATCC 700603。
1.7 碳青霉烯酶检测
将耐IPM或MEM的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌分别采用改良Hodge试验（MHT，指示菌为大肠埃希菌ATCC 25922）、铜绿假单胞菌改良Hodge试验（PAE-MHT，指示菌为肺炎克雷伯菌ATCC 700603）两种方法进行碳青霉烯酶检测。阳性质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705，阴性质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。用生理盐水配制0.5麦氏标准的指示菌，再用盐水1∶1稀释，按常规纸片扩散法程序接种 MHA，使平板干燥 3～10 min，使用 10μL接种环挑取血琼脂平板过夜生长的3～5个试验菌落或质控菌株，从纸片边缘向外划直线，划线长20～25 mm，在平板表面放置美罗培南纸片，置空气环境，（35±2）℃培养 16～20 h。 如果在抑菌圈与试验菌株或质控菌株划线交叉处出现增强生长现象，则表示碳青霉烯酶阳性，如无增强现象则碳青霉烯酶阴性。
1.8 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，采用Kappa检验评价两种改良Hodge试验的一致性，当Kappa＞0.7时，两者一致性较好，当0.4≤Kappa≤0.7时，两者一致性一般，当Kappa＜0.4时，两者一致性较差。
2 结果
2.1 非发酵菌的种类及分布
156株非发酵菌主要为：鲍曼不动杆菌 （76/156）、铜绿假单胞菌 （48/156）、嗜麦芽窄食单胞菌 （17/156）及其他（15/156）（表 1）。 这些标本主要来自于 ICU（103/156）、呼吸内科（15/156）、神经外科（16/156）、神经内科（8/156）及其他科室（14/156）。76.2%的菌株来自痰液、呼吸道导管、支气管灌洗液等呼吸道标本，其余依次为胆汁引流液、穿刺液、创面分泌物、尿液、脓液、其他标本。
表1 156株非发酵菌的分布
2.2 主要非发酵菌的耐药谱
鲍曼不动杆菌对CLSI推荐的15种抗菌药物耐药率为28.9%～100.0%，耐药率较低的抗菌药物是头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、左旋氟氧沙星；铜绿假单胞菌耐药率为31.6%～93.2%，耐药率较低的抗菌药物是哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星；嗜麦芽窄食单胞菌耐药率为21.2%～100.0%，对亚胺培南耐药率最高为100.0%，同时对头孢吡肟也表现出高度耐药达95.7%，耐药率较低的抗菌药物是头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、复方新诺明、左旋氧氟沙星。其他非发酵菌株因分离株数过少，不具代表性，故没有给与耐药谱分析。见表2。
表2 主要非发酵菌对抗菌药物的耐药率（%）
2.3 产β-内酰胺酶细菌的检出率
76株鲍曼不动杆菌中初筛阳性58株，经确认试验检测产ESBLs 21株，检出率为27.6%；48株铜绿假单胞菌中初筛阳性41株，经确认试验检测产ESBLs 18株，检出率为37.5%；ESBLs总检出率为31.45% 。
2.4 产碳青霉烯酶细菌的检出率及两种改良Hodge试验的比较
82株碳青霉烯类耐药非发酵菌中，鲍曼不动杆菌52株，铜绿假单胞菌30株。两种改良Hodge试验检测鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶的一致性较好，Kappa值为0.86（表3）；两种改良Hodge试验检测铜绿假单胞菌碳青霉烯酶的一致性一般，Kappa值为 0.58（表 4）。
表3 两种改良Hodge试验检测鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶情况（株）
表4 两种改良Hodge试验检测铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶情况（株）
3 讨论
在分离的156株非发酵菌中，鲍曼不动杆菌居于首位（48.72%），其次是铜绿假单胞菌（30.77%）和嗜麦芽窄食单胞菌（10.90%），结果与国内学者鞠晓红等[1]的报道一致。本研究收集的非发酵菌主要来自ICU，与任利珍等[2]报道一致。原因可能为ICU患者年龄偏大，不但多存在较严重的基础疾病，并且常接受侵入性检测和介入治疗，住院期间长时期使用多种广谱抗菌药物，使得耐药率高的非发酵菌定植生长。全国医院感染监测网历年统计均表明，呼吸系统感染为各部位医院感染之首。本研究显示，呼吸道感染占76.2%，与朱道等[3]的报道一致。
对多种抗菌药物天然耐药以及使用抗菌药物后又发生获得性耐药，是非发酵菌耐药性的一个重要特点[4]，如产生ESBLs，和氨基糖苷类修饰物、外膜蛋白改变、DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ基因突变引发耐药[5]，同时整合子-基因盒系统在铜绿假单胞菌的耐药中发挥重要作用[6]。鲍曼不动杆菌被称为革兰阴性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，携带多种耐药基因，对多种抗菌药物具有天然耐药性。本研究显示，鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、左旋氟氧沙星耐药率为28.9%、58.8%、56.0%，对其余抗菌药物耐药率均大于65.0%，临床可根据药敏结果选用适合的抗菌药，其中，对亚胺培南和美罗培南的耐药率高达68.6%，意味着其对现有多种抗菌药物耐药，提示临床应严格掌握碳青酶烯类抗菌药物的适应证。铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率达62.4%，哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星对铜绿假单胞菌具较好抗菌活性，耐药率分别为36.3%、31.6%、37.5%、36.0%，与王志勤等[7]的报道一致。第三、四代头孢菌素对革兰阴性杆菌具较强抗菌活性，本研究显示，铜绿假单胞菌对其的耐药性较高，这给临床抗感染构成严重威胁，并易导致抗感染治疗的失败。本研究显示，嗜麦芽窄食单胞菌对亚胺培南天然耐药，头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、复方新诺明、左旋氧氟沙星对其具有较强的抗菌活性，耐药率分别为36.3%、36.4%、21.2%、32.8%，其对头孢类抗生素的耐药率较高，均大于60%。
铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌产ESBLs阳性率分别占37.5%、27.6%，与张德忠等[8]的报道一致。铜绿假单胞菌产ESBLs株对亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦耐药率较低，对其余抗菌药物的耐药率较高；鲍氏不动杆菌产ESBLs株对亚胺培南、美罗培南、头孢吡肟、阿米卡星耐药率较低，对其余抗菌药物的耐药率较高。
碳青霉烯酶的临床实验室检测对于确定适当的治疗方案和实施感染控制措施具有重要意义。MHT已被广泛应用于碳青霉烯酶的常规实验室检查，由于其操作简单，CLSI推荐用MHT试验来检测肠杆菌科是否产生碳青霉烯酶，但是该方法并不能检测出产碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌感染。Pasteran等[9]研究利用标准化的MHT来检测肠杆菌时发现作为质控菌的ATCC25922被大部分的待测菌抑制，结果显示为不确定。Lee等[10]的报道中也出现了类似的结果。当改用肺炎克雷伯菌ATCC700603作为指示菌时，可以避免这种抑制生长现象的出现，并且具有高重复性和最佳的灵敏度和特异度，因此，将此命名为铜绿假单胞菌改良Hodge试验（PAEMHT）。鉴于此，本实验分别采用MHT和PAE-MHT两种方法检测鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌碳青霉烯酶的产生，并且比较其检测能力。检测鲍曼不动杆菌，两种方法的一致性较好；检测铜绿假单胞菌时，两种方法一致性较差，PAEMHT优于MHT，并且PAE-MHT没有出现不确定的结果。提示用肺炎克雷伯菌ATCC 700603作为质控菌的PAE-MHT试验能常规检测出碳青霉烯酶阳性的铜绿假单胞菌。
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