林焕泽 吴秀荣 陈建华 梅全喜 梁林源 杨丽华 洪建云 陈金明
1.广东省茂名市人民医院，广东茂名 525000；2.广州中医药大学附属中山医院，广东中山 528401；3.广东省茂名市药品检验所，广东茂名 525000；4.广东省电白县南药药业有限公司，广东电白 525000
沉香为瑞香科植物白木香Aquilafia sinensis，（Lour.）Gilg含有树脂的木材，为广东着名的地产药材。沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效，用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急[1]。白木香叶为白木香的非药用部位，吴秀荣等[2]、李红念等[3]、林焕泽等[4]、Minhua 等[5]、林芳 花等[6]采用白 木 香叶提取物和沉香药材做了一系列的对比试验，发现白木香叶提取物具有沉香功效的一些相同的特点，如抗炎、镇痛、降糖、平喘、抗氧化、延缓衰老作用等功效，而且效果显着。而白木香叶代泡茶是由白木香叶粉碎成粗粒，配以甘草等药材，研制成的饮用茶，其具有降气温中、暖肾纳气、治肝郁、降肝气、和脾胃、消湿气、利水开窍等功效，而且降糖、降脂、益气益精、助睡眠、饮用方便，效果显着。白木香叶代泡茶的保健效果已有相关研究[7]，而关于白木香叶代泡茶质量标准方面的研究，国内外均无报道，为此，笔者根据其功效对其中可能含有的主要成分设计了定性鉴别，并对其中所含的黄酮含量进行了测定，以期为白木香叶代泡茶质量标准的制定提供参考。
1 仪器与试药
1.1 主要仪器
岛津LC-20A高效液相色谱仪，LC-20AT高压泵，SPD-M20A检测器，CBM-20A系统控制器，SIL-20A自动进样器，TU-1901型紫外可见分光光度计，KQ-500型超声波清洗器。
1.2 主要试药
槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406），白木香叶代泡茶（茂名市君元沉香种植发展有限公司提供，批号：20120901、20120902、20120903、20120904、20120905）， 甲醇及乙醇均为色谱纯，水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 理化鉴别
2.1.1 乙醇提取液的制备
称取代泡茶粗粉10 g，加入100 mL 95%乙醇，加热回流1 h，过滤，加水稀释至含醇70%的醇液，转入分液漏斗，加入等量石油醚萃取，除去叶绿素后，得乙醇提取液。
2.1.2 滤纸层析预试法
白木香叶乙醇提取液展开剂：95%乙醇显色剂，10%磷钼酸乙醇液。
混合指示剂：5 mL 0.1%甲基红乙醇溶液、15 mL 0.1%甲基橙水溶液、20 mL 0.1%石蕊水溶液，混合均匀；氨气；0.5%醋酸镁甲醇液。
点样量：0.1 mL。
显色方法：取直径12 cm的普通圆型滤纸一张，将滤纸折划分为4份，滤纸中心打一小孔，备插入滤纸芯之用，用毛细管将样品乙醇提取液点在距纸中心约l cm处，点样后，将一小条滤纸芯插入滤纸的中心小孔，移至盛有展开剂的直径为14 cm的培养皿中，进行层析。待溶剂的前沿达到滤纸近边缘后，取出滤纸，待溶剂挥发后，将滤纸剪为4份，分别喷以不同显色剂。从滤纸上出现的颜色斑点，初步确定样品的成分。
结果如下：盐酸-镁粉反应，红色；碱性酒石酸试验，棕红色沉淀；a-萘酚试验，界面出现紫红色环；茚三酮反应，深紫色。
2.2 薄层色谱法（TLC）
取本品粉末4 g，加水30 mL乙醇回流l h，趁热过滤，滤液浓缩至干，残渣加甲醇10 mL使溶解，作为供试品溶液。另取白木香叶代泡茶对照品，白木香叶子粉末4 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述溶液各4 μL分别点于同一聚酰胺薄层板上，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲酸（5∶5∶0.5）为展开剂，饱和 30 min展开，取出，晾干。置紫外灯光（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.3 高效液相色谱法（HPLC）测定白木香叶代泡茶中的总黄酮含量
2.3.1 样品溶液的制备
2.3.1.1 对照溶液的制备 精密称取槲皮素对照品10.01 mg，加70%乙醇溶解并稀释至100 mL，再精密量取10 mL加甲醇稀释至25 mL，作为标准贮备液（槲皮素 40.04 μg/mL）。
2.3.1.2 供试品溶液的制备 取白木香叶代泡茶样品约0.1 g，粉碎，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇25 mL后，精密称定，超声处理30 min，静置室温，再加70%乙醇补足减失的重量。
2.3.1.3 阴性对照溶液的制备 取白木香叶代泡茶中除去白木香叶外其它所有成分，按照“2.2.1.2”项下供试品的制备方法，制备阴性对照溶液；
2.3.2 方法学考察
2.3.2.1 色谱条件与系统适用性 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（Shimadzu，150 mm×4.6 mm，5 μm，C18柱），以甲醇-0.15%磷酸水溶液（50∶50）为流动相，检测波长为 337 nm，柱温为35℃，流速为1.0 mL/min。结果表明，在此条件下，槲皮素可以与相邻杂质峰有较好的分离，阴性对照溶液槲皮素出峰位置无杂质干扰，该方法的系统适用性良好。
2.3.2.2 线性范围 精密量取“2.2.1.1”项下标准贮备液适量，加70%乙醇分别稀释制成浓度为0.8008、1.6016、3.2032、4.0040、6.0060、8.0080 μg/mL 的溶液，精密量取10 μL进样分析，以峰面积（y）为纵坐标，以进样浓度（x）为横坐标进行线性回归，可得回归方程y=37 767x-187.19，r=0.9995，结果表明在本含量测定方法条件下，槲皮素浓度在0.8008～8.0080 μg/mL浓度范围内，其浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系。
2.3.2.3 精密度试验 取线性范围项下浓度为6.006 μg/mL的槲皮素对照溶液，连续测定5次，RSD为0.53%，表明仪器的精密度良好。
2.3.2.4 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h分别进样分析，记录色谱图。结果表明供试品溶液在室温放置8 h内稳定性良好。槲皮素的峰面积RSD为1.29%。
2.3.2.5 重现性试验 取样品平行提取制备6份供试品溶液，分别测定其总黄酮的含量，RSD为0.87%，表明该方法的重现性良好。
2.3.2.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的白木香叶代泡茶，分别加入槲皮素对照品适量，按供试品溶液的制备方法平行制备9份供试品，并测定其槲皮素的含量，槲皮素的平均回收率为98.15%，RSD为0.74%，结果表明本方法的回收率良好。结果见表1。
表1 回收率试验结果
2.3.2.7 样品中总黄酮含量测定 取白木香叶代泡茶产品（5批），照“2.3.1.2”项下方法制备供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过后进样分析，所得结果见表2。
表2 样品测定结果
3 讨论
3.1 理化鉴别
张雪梅等[8]、Jie等[9]对沉香叶中所含的化学成分进行研究发现，白木香叶中含有多糖、氨基酸、黄酮及苷类、酚类，和a-葡萄糖苷酶等降糖因子等，这些化学成分具有多种生理活性，例如，多糖具有抗癌、增强免疫、抗病毒等作用，笔者预测杀青炮制后的白木香叶代泡茶依然富含这些成分，针对猜想，设计的理化鉴别，盐酸-镁粉反显红色，说明含有黄酮类；碱性酒石酸试验，呈现棕红色沉淀，说明含有还原糖；a-萘酚试验，界面出现紫红色环，说明含有苷类或多糖；茚三酮反应，深紫色，说明含有氨基酸。实验结果和预测结果相一致，说明了白木香叶代泡茶至少含有黄酮类、还原糖、苷类或多糖、氨基酸。这方法适用于检测白木香叶代泡茶的的有效成分，检验白木香叶代泡茶质量，操作简单有效。
3.2 TLC
该产品的薄层色谱鉴别，结果表明，白木香叶代泡茶混入的其他药材对实验影响不大，直接使用白木香叶进行参照对比，专属性和重现性良好，非常适用于白木香叶代泡茶的真伪鉴别，结果准确有效，而且方法简单方便可行，为其质量标准的制定奠定了基础。
3.3 HPLC测定白木香叶代泡茶中的总黄酮含量
黄酮类化合物是沉香叶中所含的主要的一类化合物，黄酮类化合物在自然界中是活性较好的一类化合物，据报道具有祛痰、平喘、增强免疫功能等作用[10-11]。为了明确这类成分在沉香叶中的含量，为白木香叶代泡茶的质量标准奠定基础，本产品以高效液相色谱法测定白木香叶代泡茶中槲皮素的含量作为产品中总黄酮含量的衡量依据，不仅回收率较高，线性良好，而且操作简单。此方法可以用总黄酮含量为标准，来衡量白木香叶代泡茶的质量达标情况，能有效地控制白木香叶代泡茶的质量。为白木香叶代泡茶质量标准的制定提供了有意义的参考。
3.4 小结
白木香主要产于广东和海南两地，野生资源稀少，是我国特有的珍稀药用植物，因此科学、合理开发白木香，扩大其应用领域，是当今研究的热点和重点之一[12]。基于白木香珍贵的药用功效及其资源其面临枯竭的现状，开发白木香其他部位资源迫在眉睫。由于白木香叶资源丰富，且其具有白木香部分相同功效的特点，因而探讨白木香叶代替沉香药材的可行性是沉香研究开发中的一个重要的研究方向[12]，具有极大的经济效益。本文通过理化鉴别、薄层色谱鉴别及高效液相法对白木香叶代泡茶的质量标准进行分析，为人们更多更深入地研究沉香叶代泡茶提供依据，对于实现白木香资源的综合利用，提高白木香的经济价值具有积极地现实意义。
本文建立的定性及定量方法简单可行、重复性好，能有效地控制白木香叶代泡茶的质量，为白木香叶代泡茶质量标准的制定提供了有意义的参考。为用药安全和开发利用该药用植物资源提供科学依据。
测定白木香叶代泡茶中的总黄酮含量还可以使用芦丁做对照品，或者使用紫外分光光度法，具体效果，要待进一步的实验进行比较，取最优方案。
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