人工麝香对卵白蛋白致敏小鼠气道炎症损伤的保护作用

破鸭梨 ⋅ 2024-06-28 02:24:32 ⋅ 阅读 ⋅ 检验与临床论文

袁绍鹏++白金叶+章菽+程桂芳+侯琦

[摘要] 目的研究人工麝香对卵白蛋白（OVA）致敏引发的小鼠气道炎症损伤的保护作用及其机制。方法雄性Balb/c小鼠分别于第0天和第14天腹腔注射20 μg OVA和2.25 mg Al（OH）3凝胶致敏，于第28、29、30天从气管滴入OVA进行攻击，攻击前1 h给予受试化合物人工麝香及阳性药地塞米松。小鼠随机分为6组：正常对照组（n=11）、模型组（OVA组，n=10）、地塞米松组（Dex组，n=10）、人工麝香给药10 d组（n=11）、人工麝香给药7 d组（n=13）、人工麝香给药5 d组（n=11）。人工麝香皮下给药100 mg/kg，分别自致敏第21、24、26天开始给药，给药周期为10、7、5 d。处死小鼠后，对小鼠的体重、脾脏和胸腺进行称重，计算脾脏、胸腺指数。检测支气管肺泡灌洗液（BALF）炎症细胞及炎症因子IL-4、IL-5及IL-17含量改变，HE染色分析小鼠肺部病理变化，免疫组化分析中性粒细胞生物标志物Ly6G/Gr-1的表达水平。结果与模型组相比，人工麝香100 mg/kg连续给药5、7 d可改善OVA致敏引发的小鼠气道炎症，明显降低小鼠BALF炎症细胞因子IL-4、IL-5、IL-17的含量（P < 0.05）。细胞分类计数、肺组织病理分析及免疫组化结果表明，人工麝香能够抑制小鼠肺部气道中炎症细胞，特别是中性粒细胞的浸润，以及中性粒细胞标志物Ly6G/Gr-1的表达。结论人工麝香具有较强的减轻OVA致敏引发的小鼠气道炎症损伤的功能，提示人工麝香对于哮喘可能有一定的治疗作用。

[关键词] 人工麝香；哮喘；气道炎症；中性粒细胞；白介素17

[中图分类号] R285.5[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（b）-0004-05

Investigation for the effects of artifitial musk on attenuation of OVA-challenged murine airway inflammation

YUAN Shaopeng1 BAI Jinye1 ZHANG Shu2 CHENG Guifang1 HOU Qi1▲

1.Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China; 2.Beijing Lianxin Pharmaceutic Co., Ltd., Beijing 102600, China

[Abstract] Objective To investigate the effects of artifitial musk on attenuation of OVA-challenged murine airway inflammation in vivo and its mechanism. Methods Male Balb/c mice were divided into 6 groups, including control (n=11), OVA model (n=10), Dex (n=10), artifitial musk 10 days (n=11), artifitial musk 7 days (n=13), and artifitial musk 5 days (n=11). Mice were immunized intraperitoneally with 20 μg ovalbumin (OVA) and 4 mg Al(OH)3 suspended in 0.1 mL saline solution on Day 0 and Day 14, and then intratracheally challenged with 1% OVA suspended in saline solution on Days 28-30. Artifitial musk (100 mg/kg, s.c.) was given 1 hour before each OVA challenge for 5, 7 and 10 days since the sensitization for 21, 24, 26 days, respectively. After sacrificed, the body weights, spleen index and thymus index were calculated. In addition, pathologic changes in the lung tissues, number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and expression levels of IL-4, IL-5, IL-17 were observed. Moreover, the expression levels of Ly6G/Gr-1, a major biomarker of neutrophil, was detected by immunohistochemical examination. Results Compared with OVA model, the airway inflammation in mice improved after treatment with 100 mg/kg artifitial musk for 5 and 7 days in vivo. Moreover, the expression levels of major cytokines as IL-4, IL-5 and IL-17 in BALF were inhibited after treatment with musk (P < 0.05). Pathological and cell count results showed that the inflammatory cell especially neutrophile granulocyte infiltration in the airway section reduced after treatment with artifitial musk. Furthermore, immunohistochemical examination results showed that the expression levels of Ly6G/Gr-1 were inhibited upon the treatment. Conclusion The results showed that artifitial musk possesses inhibitory effects on airway inflammation induced with OVA in vivo and the therapeutic function on asthma in the future.

[Key words] Artifitial musk; Asthma; Airway inflammation; Neutrophil; IL-17

哮喘是由气道慢性炎症引起的肺部疾病，既往认为Ⅰ型辅助性T淋巴细胞（Th1）与Ⅱ型辅助性T淋巴细胞（Th2）在数量、活化及功能方面的失衡是哮喘发病的重要环节，从而引起Th2型淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等失调白介素（IL）-4、IL-5、IL-13等Th2型炎症因子的过量表达，最终导致气道炎症和气道高反应性（AHR）的发生[1-2]。近年来的研究发现，中性粒细胞在哮喘气道炎症发生过程中发挥重要作用[3]。中性粒细胞不仅可以导致急性哮喘的恶化，还大量存在于慢性重症哮喘患者的气道中。中性粒细胞具有趋化、吞噬、产生氧自由基及释放作用等功能。除了重要的防御作用外，中性粒细胞可以引起感染部位的炎症，使炎性反应进一步加重，引起病理性损害。因此，通过抑制中性粒细胞在气道炎症微环境中的过度表达，对治疗哮喘，特别是严重性哮喘，将可能发挥重要的功能[4]。新近研究表明，炎症因子IL-17在调控哮喘中性粒细胞浸润过程中发挥重要的功能，是目前哮喘治疗及药物研发的新型作用靶点[5-6]。麝香是中国传统医药中极其珍贵的药品之一，对心血管、神经系统、呼吸系统、内分泌及免疫功能均有广泛的影响[7]。自20世纪70年代，中国医学科学院药物研究所科研人员利用现代药学和生物学理论和技术，在对麝香的化学和药理学进行了系统深入的研究的基础上，制备了人工麝香。本课题组既往的研究结果证明，麝香中水溶性多肽蛋白质具有显着地抑制中性粒细胞的功能[8]，能够抑制中性粒细胞活性脂质生成、游离Ca2+水平以及细胞内容物的释放，从而发挥抗炎免疫调节活性。本文研究人工麝香对卵白蛋白（OVA）引发的小鼠气道炎症的活性，考察其对相关炎症细胞因子，如IL-4、IL-5和IL-17等表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Balb/c小鼠，（20±2）g，SPF级，由中国医学科学院实验动物研究所提供[合格证：SCXK-（京） 2009-0007]。

1.2 药物与试剂

OVA（美国Sigma公司），人工麝香（北京联馨药业有限公司），地塞米松（Sigma公司分装）。IL-4、IL-5和IL-17 ELISA检测试剂盒购自BioLegend公司。Ly6G/Gr-1抗体购自R&D公司。

1.3 动物分组及模型建立

小鼠随机分为6组：正常对照组（n=11）、模型组（OVA组，n=10）、地塞米松组（Dex组，n=10）、人工麝香给药10 d组（n=11）、人工麝香给药7 d组（n=13）、人工麝香给药5 d组（n=11）。小鼠分别于第0天和第14天腹腔注射20 μg OVA和2.25 mg Al（OH）3凝胶，第28、29、30天将100 μg OVA溶解在50 μL生理盐水中，以气管滴入方式进行攻击，攻击前1 h给予人工麝香及阳性药地塞米松。

1.4 给药方式和初始剂量

人工麝香，100 mg/kg剂量皮下给药，分别自致敏第21、24、26天开始给药，给药周期为10、7、5 d。阳性药地塞米松，1 mg/kg，灌胃给药。

1.5 检测指标

1.5.1 动物死亡记录和称重动物死亡情况随时记录，处死小鼠后，对小鼠的体重、脾脏和胸腺进行称重，计算脾脏、胸腺指数。

1.5.2 支气管肺泡灌洗液炎症细胞及炎症因子检测小鼠在末次激发后24 h，切开颈部皮肤暴露气管，插入灌流针，用预冷的PBS 1 mL行肺部灌洗3次，吸出支气管肺泡灌洗液（BALF）液，4℃离心5 min，细胞沉淀用PBS缓冲液重悬，以全自动血球分析仪进行细胞分类计数。上清用ELISA方法分析BALF中IL-4、IL-5、IL-17含量。

1.5.3 小鼠肺部病理分析取出小鼠完整的左侧肺组织，用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察对比各组小鼠肺组织病理形态学改变。

1.5.4 小鼠肺部免疫组化分析部分小鼠肺组织用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行免疫组化检测，分析其中中性粒细胞生物标志物Ly6G/Gr-1的表达水平。具体步骤为：石蜡切片常规脱蜡至水；3%过氧化氢（H2O2）孵育10 min，去除内源性过氧化物酶；微波处理；加入二抗同源的正常血清封闭20 min；加入一抗，置于湿盒4℃ 过夜；加二抗室温孵育2 h；加入链霉亲和素辣根过氧化物酶复合物20 min；二氨基联苯胺（DAB）显色5 min；双蒸水冲洗，常规苏木精复染、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。结果判定：细胞核清晰、胞质有黄色或褐色着色的细胞为阳性细胞。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物体重、脾脏及胸腺指数的变化

与模型组相比，给予人工麝香5、7、10 d后，小鼠的胸腺指数未见显着变化，但是小鼠脾脏指数呈现剂量相关性的增加。各组动物体重、脾脏及胸腺指数的变化见表1。

2.2 支气管肺泡灌洗液中白细胞、淋巴细胞及中性粒细胞计数

如图1和表2结果所示，与正常对照组相比，模型组小鼠BALF中白细胞、淋巴细胞以及中性粒细胞计数明显升高（P < 0.05）；与模型组比较，人工麝香100 mg/kg连续给药5、7 d可明显抑制小鼠气道炎症细胞的增加，以及淋巴细胞、中性粒细胞的升高（P < 0.05）。但是，人工麝香连续给药10 d后，与模型组相比，未见明显的治疗活性（P > 0.05）。因此，本研究后续重点关注人工麝香连续给药5 d和7 d的情况。

与正常对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

图1 小鼠支气管肺泡灌洗液中主要炎症细胞分类计数

表2 小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞、淋巴细胞

及中性粒细胞计数（104/mL，x±s）

注：与正常对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

2.3 支气管肺泡灌洗液中炎症因子表达量分析

炎症因子对小鼠气道炎症细胞的招募与浸润发挥重要的调节作用，本研究进一步检测了气道灌洗液中Th2炎症因子IL-4、IL-5及中性粒细胞关键调控因子IL-17的含量。如图2和表3结果所示，与正常对照组相比，模型组小鼠BALF液中炎症因子IL-4、IL-5和IL-17的含量显着升高（P < 0.01）；与模型组相比，人工麝香治疗有效组，即给药5 d和给药7 d后，均明显抑制小鼠气道炎症因子的含量（P < 0.01），其中，人工麝香能明显抑制IL-17蛋白含量（P < 0.001），且活性高于阳性药地塞米松。

与正常对照组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

图2 小鼠支气管肺泡灌洗液中主要炎症因子含量

表3 小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症因子表达（pg/mL，x±s）

注：与正常对照组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；IL-4：白介素4；IL-5：白介素5；IL-17：白介素17

2.4 小鼠肺组织病理分析

小鼠肺部病理结果表明，与正常对照组相比，模型组小鼠肺间质有大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润。与模型组相比，人工麝香治疗有效组，间质散在少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，提示人工麝香能有效抑制小鼠气道炎症细胞的浸润及侵袭。见图3。

2.5 免疫组化分析小鼠肺组织Ly6G/Gr-1表达

小鼠肺部免疫组化分析结果表明，与正常对照组相比，模型组小鼠肺部中性粒细胞标志物Ly6G/Gr-1的表达明显升高；与模型组相比，人工麝香治疗有效组，Ly6G/Gr-1的表达被显着抑制，提示人工麝香能有效抑制小鼠气道中性粒细胞的招募以及受体蛋白的表达。见图4。

3 讨论

麝香作为一种重要的治疗非特异性炎症的药物，已经在临床上取得一定的效果，其抗炎免疫活性已有相关报道。然而尽管有文献报道人工麝香在临床中可用于治疗哮喘，特别是对顽固性慢性哮喘有效，但对于其相关作用机制的研究未见报道。本研究实验结果初步证明，人工麝香具有明显的抗炎及免疫抑制活性，100 mg/kg连续给药5、7 d可有效抑制小鼠气道炎症，降低气道内炎症细胞及炎症因子的含量。有意义的是，人工麝香能够显着抑制慢性炎症因子IL-17的表达以及中性粒细胞的招募和浸润，这些研究结果部分解释了人工麝香治疗哮喘，特别是顽固性哮喘的分子机制。

近年来，中性粒细胞在哮喘，特别是顽固性哮喘发病及进展过程中的活性日益受到关注[9]。既往认为，Th2型淋巴细胞以及嗜酸性粒细胞的增加是哮喘发病的重要原因。但是，临床研究结果证明，40%~50%的哮喘患者中Th2型淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等未见显着变化[10]。尤其是近年来，针对IL-5等嗜酸性粒细胞趋化因子的药物在临床治疗中未取得预期疗效，进一步证明有其他的炎症细胞参与了哮喘的发生及进展。越来越多的研究证明，中性粒细胞在哮喘的发生过程中，特别是严重性哮喘的发病中发挥重要的作用。除了重要的防御作用外，中性粒细胞可以引起感染部位的炎症，使炎症反应进一步加重，引起病理性损害[11]。人工麝香中水溶性多肽蛋白质具有显着的抑制中性粒细胞的功能。既往研究证明，人工麝香能够抑制中性粒细胞活性脂质生成、游离Ca2+水平以及细胞内溶物的释放，从而发挥抗炎免疫调节活性。本研究研究结果表明，在OVA致敏的小鼠气道中，有显着性的中性粒细胞增加，以及其生物标志物Ly6G/Gr-1含量的升高。这进一步证明人工麝香在体内可能通过抑制中性粒细胞的招募和浸润，发挥抗炎免疫调节活性。同时，本研究结果也证明，通过抑制中性粒细胞在气道中的侵袭和浸润，对治疗哮喘气道炎症，将可能发挥重要的功能。

IL-17在调控中性粒细胞的趋化过程中发挥重要的功能。IL-17通过调控气道微环境中的结构细胞及炎症细胞，促进中性粒细胞趋化及调控因子的表达和分泌，从而促进中性粒细胞的招募、黏附及浸润[12]。本研究研究结果表明，人工麝香能显着抑制气道灌洗液中IL-17的表达含量，其活性甚至强于地塞米松。这一结果提示，人工麝香可能通过抑制IL-17的表达，进而影响了气道内中性粒细胞的招募、黏附等活性，从而抑制中性粒细胞在气道内的浸润，发挥治疗哮喘气道炎症的活性。由于文献报道，人工麝香对顽固性哮喘具有显着的疗效，本研究结果将有助于解释人工麝香治疗哮喘，特别是顽固性哮喘的分子机制[6，13]。

本研究也探索了在有效治疗剂量下，不同给药天数对小鼠气道炎症的抑制活性。有意思的是，人工麝香的治疗活性有一定的时间窗。当给药10 d后，未观察到显着的炎症细胞抑制活性。由于未进行体内药代动力学研究，笔者推测当给药天数增加后，可能会促进体内拮抗因子或细胞的增加，从而抵消甚至促进机体的免疫反应。因此，未来的实验中，除了检测体内的药物代谢时间及药物分布外，也需要检测相关抗体等，从而综合评价及指导人工麝香的用药及治疗。

综合以上研究，本研究初步实验结果表明，人工麝香具有显着的抗炎免疫调节活性，能够抑制小鼠气道炎症，炎症细胞趋化和浸润以及炎症因子的表达。以上结果，对于未来研发哮喘治疗药物，提供了重要的理论及实验依据。

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（收稿日期：2014-03-16本文编辑：程铭）

[基金项目] 教育部高等学校博士学科点专项科研基金（编号2010 1106120023）。

[作者简介] 袁绍鹏（1977.11-），男，博士；研究方向：免疫抑制剂研究。