转化生长因子-β2、胰岛素样生长因子-Ⅰ在豚鼠形觉剥夺性近视眼视网膜的表达及作用

田军郑州市第二人民医：眼科，河南郑州450000

转化生长因子-β2、胰岛素样生长因子-Ⅰ在豚鼠形觉剥夺性近视眼视网膜的表达及作用

田军
郑州市第二人民医：眼科，河南郑州450000

目的建立豚鼠形觉剥夺性近视眼模型，研究视网膜转化生长因子-β2（TGF-β2）mRNA、胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA在形觉剥夺性近视眼的变化及作用。方法出生3 d的实验用花色豚鼠45只，半透明眼罩遮盖左眼，右眼为对照眼。遮盖4周实验结束时，RT-PCR检测后极部视网膜中TGF-β2mRNA、IGF-ⅠmRNA的表达水平。结果遮盖4周后遮盖眼形成明显的近视，TGF-β2mRNA在遮盖眼表达量为（0.437±0.032），对照眼为（0.671±0.048），遮盖眼表达量较对照眼下降，差异有高度统计学意义（t=11.653，P＜0.01）；IGF-ⅠmRNA在遮盖眼表达量为（1.817±0.144），对照眼为（1.536±0.113），遮盖眼表达量较对照眼升高，差异有高度统计学意义（t= 7.194，P＜0.01）。结论TGF-β2、IGF-Ⅰ参与豚鼠形觉剥夺性近视形成。

形觉剥夺；近视眼；视网膜；转化生长因子β2；胰岛素样生长因子-Ⅰ

近视是导致视力下降的首位原因，在发达国家，病理性近视已成为失明的主要原因［1］。近视已成为全世界的公共卫生问题。1999～2004年美国国家营养监测和健康调查组的研究结果表明，近视在20～39岁美国人群的发病率较高，50%以上的大于20岁的美国人受到影响。在美国，男性的近视患病率要比女性低，男性为32.6%，女性为39.9%（P＜0.01）［2］。我国近视眼的患病率急剧增加，在世界上的排名仅次于近视眼第一大国日本。目前我国近视眼的患者已超过3亿，我国近视患病率在小学达到10%，中学达到40%，大学达到70%。在新加坡学龄儿童近视的调查中发现，其近视的发生率高于中国同龄儿童，7、8、9岁儿童中，近视发生率分别为47.6%、37.4%、32.5%［3-4］。近视被分为低、中和高度近视，3.00以下为低度近视，-3.00～6.00 D为中度近视，＞6.00 D为高度近视［5］。高度近视又称病理性近视或变形性近视，因矫正视力不理想，眼轴不断延长，影响人们学习和工作。高度近视由于后巩膜葡萄肿可引起视网膜脉络膜病变，视网膜神经纤维层厚度逐渐变薄，神经纤维层指数增加，视网膜色素上皮细胞的表面积增加，视网膜色素上皮层变薄，脉络膜厚度随眼轴延长而改变［6-7］。通过建立形觉剥夺动物模型，有助于研究其发病机制，利于防止近视发生和发展。近年研究表明形觉剥夺性近视主要是通过局部视网膜机制调控巩膜重塑的过程，眼球后极部视网膜表达的各种活性细胞因子的水平与形觉剥夺性近视眼的形成有关。本实验以豚鼠为研究对象，研究转化生长因子-β2（transforming growth factor-beta 2，TGF-β2）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulinlike growth factor-1，IGF-Ⅰ）在形觉剥夺性近视眼视网膜表达的变化规律，为形觉剥夺性近视的防治提供新途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

出生3 d的小豚鼠45只（郑州大学医学：动物中心提供），室内标准化饲养，白天用自然光照射，每日光照与黑暗周期比为14∶10，室温控制在24℃。出生后第3天对豚鼠进行检影验光，排除先天性近视及眼部疾病。右眼为自身对照眼，半透明眼罩遮盖左眼作为形觉剥夺眼。

1.2 方法

1.2.1 屈光度测量、取材分别于出生后第3天、遮盖4周时在暗室用1%复方托哟卡胺眼液散瞳后带状光检影检测双眼屈光度。实验结束后深麻醉处死动物，取后极部视网膜组织，置于1.5 mL RNase-free的EP管中，保存于-80℃的低温冰箱内备用。

1.2.2 逆转录聚合酶链反应Trizol提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，1%甲醛变性凝胶电泳三条带显示清晰，确定RNA无明显降解。引物由上海生工生物技术公司合成，引物序列：TGF-β2上游5'-TGGCCACCATGCACTACTGTGTCTGAGAAC-3'，下游5'-CAGCTGCATTTACAAGACTTGAC-3'产物1325 bp；IGF-Ⅰ上游5'-ATTAGCACACTCCGATTCAT-3'，下游5'-TGGTCTTGTACTGTGCTAGT-3'，产物356 bp；内参β-actin上游5'-CGTTAGCGTCCATAATCACGTC-3'，下游5'-CCTCAAATAGTCAGCGCAGCA-3'，扩产物219 bp。25μL PCR反应体系如下：10×one step RNA PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（25 μmol/L）5 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）2.5 μL，RNase Freed H2O 10.5 μL，RNase inhibitor（40 U/μL）0.5μL，组织RNA 2 μL，AMV Rtase XL（5 U/μL）0.5 μL，AMV-optimized Taq（5 U/μL）0.5 μL，目的基因上下游特异性引物（20 μmol/L）1 μL（各0.5 μL），β-actin上下游引物（20 μmol/L）1 μL（各0.5 μL）。TGF-β2反应条件：50℃逆转录30 min，94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，32个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。IGF-Ⅰ反应条件：51℃逆转录30 min，94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环，72℃延伸5 min，4℃保存。将电泳后的PCR产物放入图橡处理系统测量产物光密度值（OD值），记录每个样本在同一反应体系中与β-actin OD值的相对比值，进行统计学分析。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 遮盖期间双眼屈光状态变化

出生3 d时，豚鼠遮盖眼屈光度为（3.37±1.56）D，对照眼（3.41±1.35）D，遮盖眼与对照眼比较，差异无统计学意义（t=0.791，P=0.649）。遮盖4周后，遮盖眼屈光度为（-2.32±1.34）D，对照眼（2.16±1.12）D，遮盖眼与对照眼比较，差异有高度统计学意义（t=-8.260，P=0.000），遮盖眼形成明显的近视。

2.2 RT-PCR分析IGF-Ⅰ和IGF-ⅡmRNA在正常和遮盖豚鼠眼视网膜的表达

遮盖4周后，TGF-β2mRNA在遮盖眼表达量为（0.437±0.032），对照眼为（0.671±0.048），TGF-β2mRNA在遮盖眼表达量较对照眼明显下降，差异有高度统计学意义（t=11.653，P=0.004）。

遮盖4周后，IGF-ⅠmRNA在遮盖眼表达量为（1.817±0.144），对照眼为（1.536±0.113），IGF-ⅠmRNA在遮盖眼表达量较对照眼明显升高，差异有高度统计学意义（t=7.194，P=0.001）。

3 讨论

形觉剥夺即通过遮盖、缝合眼睑或戴凹透镜等方法，使幼年实验动物的视网膜成橡模糊，得不到清晰物象的刺激，眼轴逐渐延长即为形觉剥夺性近视。由于眼轴延长，形觉剥夺性近视眼的改变与人的病理性近视眼的改变相似：如视网膜神经纤维层厚度逐渐变薄，视网膜色素上皮细胞的表面积增加，视网膜色素上皮层变薄等。形觉剥夺性近视越来越引起人们的关注，逐渐被人们应用于研究人类高度近视的动物模型中。豚鼠近年来被广泛用于近视眼的研究，其眼球较大，成长较快，性情温和，易于饲养，且价格低廉，比较适合作为近视动物模型的研究［8-9］。本实验单眼遮盖4周，成功诱导出豚鼠剥夺性近视动物模型。

伴随着近年来对近视眼发病机理的研究，各种细胞生长因子所起的作用在近视发病原因中愈来愈受到关注。通过与近视发病有关的生长因子与视网膜、脉络膜、巩膜细胞上的各级受体结合，进行视觉信号的传递。大量研究证实视网膜对近视眼发生的调控与其合成分泌的细胞生长因子［如成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）］密切相关［10］，这些信号因子共同组成近视眼视网膜神经调控网络。目前认为形觉剥夺性近视的形成主要是通过局部视网膜机制来调节相邻巩膜主动重塑的结果。视网膜的细胞成分比较复杂，包括神经节细胞、光感受器细胞、Muller细胞等，目前还不明确有哪些细胞参与近视的形成过程，生成近视信号因子。本项目研究表明豚鼠视网膜可以检测到TGF-β2mRNA、IGF-ⅠmRNA表达，遮盖眼视网膜TGF-β2mRNA表达量较对照眼下降，IGF-ⅠmRNA表达量较对照眼升高，说明TGF-β2、IGF-Ⅰ参与了豚鼠形觉剥夺性近视的发生过程。

TGF-β是生物体内极为重要的生长因子，其生物学作用可以促进细胞的生长，也可以抑制细胞的生长，但TGF-β抑制生长作用较弱。针对不同的细胞其发挥的生物学作用也不相同。它可以促进Ⅰ型胶原的翻译、转录，促进平滑肌细胞、成纤维细胞弹性蛋白的合成，上调人成纤维细胞分泌多种蛋白多糖如：整合素、透明质酸、纤维黏连蛋白等［11］。TGF-β在眼部有3种亚型，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，玻璃体、脉络膜、视网膜均可以检测到这3种亚型。其中TGF-β2比例最大、活性最强。TGF-β2在眼球局部产生、利用、降解，分布于光感受器外节和视网膜色素上皮层，在脉络膜也有轻度表达。体外培养的视网膜色素上皮细胞、脉络膜黑素细胞均可分泌TGF-β［12］。Seko等［13］发现在鸡FDM眼后极部视网膜、视网膜色素上皮、脉络膜、巩膜TGF-β2含量增加明显。Jobling等［14］研究发现在近视发生过程中TGF-β通过改变巩膜细胞的表型，使巩膜产生较强的收缩性，降低TGF-β的表达，导致树鼠巩膜外基质发生改变，巩膜重塑，近视发生。闫磐石等［15］用RT-PCR和免疫组化的方法在豚鼠近视模型中发现视网膜TGF-β2含量下降，TGF-β2被发现主要表达于视网膜光感受器外节和色素上皮层，形觉剥夺2周视网膜TGF-β2的表达含量较对照眼降低显着。我们实验表明形觉剥夺降低视网膜TGF-β2的活性，这与闫磐石的研究结果一致。TGF-β有促进细胞外基质合成的作用，TGF-β通过抑制蛋白酶水解酶的合成，抑制基质的降解，促进蛋白酶抑制剂的分泌，增加细胞外基质沉积，促进纤维细胞或巩膜细胞的增殖［11］。

IGF-Ⅰ是一类多功能细胞增殖调控因子。在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。IGF-Ⅰ与IGF-Ⅱ具有相似的结构和体外活性，但体内的生物学效应不尽相同。IGF的生物学功能不只局限于有丝分裂刺激作用，它们也能诱导分化或促进分化功能的表达。其精确的生物学效应取决于细胞发育的状态及其他激素或生长因子的存在。尤其是在不同的组织，不同生长发育期，IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的作用及水平有相当的差异。IGF-Ⅰ依赖于GH，可促进体外培养的多种细胞增殖，促进蛋白质和DNA合成。机体许多组织细胞均能自分泌和旁分泌IGF-Ⅰ。Fisher等［16］发现IGF-Ⅰ及其受体广泛分布于鸡视网膜神经感觉层、视网膜色素上皮层、脉络膜、睫状体、晶状体赤道部，IGF-Ⅰ可以刺激视网膜Muller细胞的活性，提高其p38、MAPK、cFos的表达。一定剂量的IGF-Ⅰ联合bFGF玻璃体腔注射可以引起小鸡玻璃体腔扩大，眼轴增长，但是单独注射却IGF-1却不能引起眼轴增长［17］。国内学者研究发现豚鼠剥夺性近视眼后极部视网膜IGF1R的表达水平升高，去遮盖后，IGF1R在后极部视网膜的表达水平下降，豚鼠眼轴增长减慢，近视屈光度减低［18］，也提示IGF-Ⅰ通过IGF1R参与视网膜近视信号转导。近年研究发现儿童血清IGFBP3浓度与身高、体重、年龄、角膜屈光力、眼轴长度、屈光度的相关性无显着性差异，但血清IGF-Ⅰ浓度与儿童角膜屈光力相关性虽无显着差异，但与眼轴长度呈正相关，因此认为血清IGF-Ⅰ浓度与眼轴增长有关。在近视程度不同的儿童，其血清IGF-Ⅰ浓度也不一样，而且近视程度越高，血清IGF-Ⅰ浓度越高，充分说明IGF-Ⅰ在近视发生发展中有重要作用［19］。

形觉剥夺破坏了视网膜色素上皮和脉络膜屏障，导致视网膜上调巩膜生长的信息分子轻易通过而使巩膜过度生长［20］。推测剥夺性近视视网膜分泌的TGF-β2、IGF-1可能是通过此方式作用于巩膜细胞，直接减少胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、纤维连接蛋白、蛋白多糖等细胞外基质成分的合成，减少纤溶酶原激活物抑制剂PAⅠ-1和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs的产生，使纤溶酶和基质金属蛋白酶合成增加，细胞外基质过度降解，巩膜变薄，眼球扩张，形成近视。

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Effect of TGF-β2and IGF-Ⅰin retina of form deprivation myopia in guinea pig

TIAN Jun
Department of Ophthalmology,the Second People's Hospital of Zhengzhou City,He'nan Province,Zhengzhou450000, China

ObjectiveTo explore the effects of retinal transforming growth factor-beta 2(TGF-β2)and insulin-like growth factor-1(IGF-Ⅰ)in form-deprivation myopia guinea pig model.Methods45 three-day-old guinea pigs were selectedall left eyes were coverred with transplant goggles,and the right eyes were control eyes with no goggles.Refractive status was measured by strip light retinascopy at before experiment and after 4 weeks.Total RNA in the posterior retina was extracted at the end of 4 weeks,the expression levels of TGF-β2mRNA and IGF-ⅠmRNA were measured by PCR.ResultsForm-deprivation eyes were significantly more myopia than control eyes,.the expression level of TGF-β2mRNA in form-deprivation eyes was(0.437±0.032),that in control eyes was(0.671±0.048),two groups were compared,the difference was statistically significant(t=11.653,P＜0.01).The expression level of IGF-ⅠmRNA in form-deprivation eyes was(1.817±0.144),that in control eyes was(1.536±0.113),two groups were compared,the difference was statistically significant(t=7.194,P＜0.01).ConclusionTGF-β2and IGF-Ⅰparticipate in the development of form deprived myopia in guinea pig.

Form deprivation;myopia;Retinal;Transforming growth factor-beta 2;Insulin-like growth factor-1

R778.11

A

1673-7210（2015）07（a）-0030-04

2015-03-09本文编辑：苏畅）