川黄柏中盐酸小檗碱提取新工艺的研究

赵伟杰

台州职业技术学院生化制药研发中心，浙江 台州 318000

黄柏为传统中药材，始载于《神农本草经》，为芸香科植物黄檗或黄皮树的干燥树皮。前者习称“关黄柏”，主产于辽宁、吉林、黑龙江、河北、内蒙古等地；后者习称“川黄柏”，主产于四川、湖北、贵州、云南、陕西、广西等地[1-2]。2010年版《中国药典》记录，二者虽成分种类和成分含量上存在差异，但功能主治、用法用量均相同[3]。即具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮等功效，临床常用于治疗湿热泻痢、黄疸尿赤、带下阴痒、热淋涩痛、脚气痿躄，骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒、湿疹湿疮等病症[4]。黄柏的生物活性成分除提取物、总生物碱外，还包括了盐酸小檗碱、黄柏碱、木兰碱、巴马汀、药根碱、黄柏酮、黄柏内酯等单体化合物[5]，其中主要活性成分为盐酸小檗碱，因其具有较好的药理作用，临床应用广泛[6]。

超声波辅助提取方法具有省时、节能、提取效率高等优点，且无需加热过程，可避免加热因素引起的药物成分结构发生变化，与传统的提取方法如煎煮法、浸渍法、回流法、渗漉法相比，可以较大程度地提高目标成分的提取率[7]。本试验以川黄柏为原料，采用浸泡-超声法进行提取，并用正交试验设计方法对川黄柏中盐酸小檗碱的超声提取工艺进行优化，确定最佳工艺参数，为川黄柏的药用研究提供一定的实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KQ2200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率40 kHz，功率100 W）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率40 kHz，功率250 W）；DS-7510DTH超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司，频率40 kHz，功率450 W）；循环水式真空泵 （台州市信力电子设备有限公司）；1260高效液相高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；30B型万能粉碎机（江阴市鑫达药化机械制造有限公司）。

1.2 试药

甲醇、乙腈为色谱纯（美国Sigma-Aldrich公司），实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.l分析方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50，含 0.1%的十二烷基硫酸钠）；检测波长265 nm，流速 1 mL/min，柱温 40℃，进样量 10 μL[8-9]。色谱图见图1。

图1 盐酸小檗碱对照品（A）和供试品（B）的HPLC图

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品5.77 mg，置于5 mL量瓶中，加色谱纯乙腈溶解并定容，摇匀，制得1 mg/mL对照品储备液备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取川黄柏小片（约5 mm×5 mm）20.0 g，按一定料液比加入提取溶剂，浸泡24 h，置于超声波清洗器中在一定功率、温度下提取，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加一定浓度的NaCl水溶液 （加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。精密称定生物碱粉末，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入色谱纯乙腈25 mL，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液（在提取工艺研究中改变相应参数）。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取盐酸小檗碱对照品储备液 0.25、0.5、1、2、4 mL 置于 5 mL 量瓶中， 用色谱纯乙腈定容至刻度，同“2.1.1”项下色谱条件分别进样3次，进样量 10 μL。以平均峰面积（Y）对进样质量浓度（X）进行线性回归分析，得回归方程Y＝38 854.3878 X－84.306 14，r＝ 0.999 93， 表明盐酸小檗碱在0.05～0.8 mg/mL线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，同“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰，计算得盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.24%。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，室温下放置，分别在制备后0、1、2、4、6、8、10、12 h按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录盐酸小檗碱峰面积，并计算其峰面积的RSD为0.52%，表明稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 称取川黄柏小片6份，每份5.0 g，按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算得盐酸小檗碱质量分数的RSD为1.53%

随着信息技术和经济环境的不断发展，传统财会管理模式逐渐发生变化，我国经济发展模式正由传统的投资拉动经济增长模式转变为资本节约型经济管理模式。新时期下的企业财务转型，对财会工作人员综合能力也提出了更高要求。财务转型即借助现代信息技术及管理会计等方式，将核算型财务转变为管理决策型财务，并将财会工作积极融入到企业日常经营决策中，并充分发挥自身具备的财务管理价值。

2.1.8 回收率试验 称取川黄柏小片6份，每份5.0 g，置25 mL量瓶中，每份加入小檗碱对照品储备液适量，按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算得盐酸小檗碱平均加样回收率为98.46%，RSD为1.81%。

2.1.9 样品的测定 分别吸取对照品溶液和供试品溶液各1 mL，经0.45 μm微孔过滤器过滤进样瓶中，同“2.1.1”项下色谱条件进行测定，外标法计算，即得样品中小檗碱的质量分数。

2.2 单因素试验

以盐酸小檗碱提取率为考察指标，通过单因素试验确定影响盐酸小檗碱提取率的因素。提取率＝提取出的盐酸小檗碱质量/川黄柏质量×100%

2.2.1 提取方法的选择 称取黄柏小片20.0 g，按一定料液比加入提取溶剂，浸泡24 h，平行2份：第1组，抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加入一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末；第2组，置于超声波清洗器中在一定功率、温度下提取，趁热抽滤，滤液静置过夜，加入HCl调至pH=2，再加一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。每组提取重复3次，按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，得到超声辅助提取率为4.74%（RSD为0.42%），浸泡提取率3.21%（RSD为0.24%）。由此可见，超声辅助提取盐酸小檗碱的提取率明显高于浸提法提取的盐酸小檗碱，故采用超声辅助提取法提取盐酸小檗碱。

2.2.2 提取溶剂的选择 称取黄柏小片20.0 g，提取溶剂分别为 HCl-甲醇（1∶100）、HCl-乙醇（1∶100）、HCl-水（1∶100），按一定料液比浸泡 24 h，置于超声波清洗器中在一定功率、温度下提取，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加入一定浓度的Na-Cl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。用HCl-甲醇提取盐酸小檗碱的提取率最高，这是由于甲醇穿透植物细胞壁的能力强、极性大、对生物碱的溶解性能好，而且沸点也较低[10]，故选择HCl-甲醇为提取溶剂。见表1。

表1 提取溶剂对盐酸小檗碱提取率的影响（n=3）

2.2.3 提取剂中甲醇的所占百分比 称取黄柏小片20.0 g，提取溶剂分别为 HCl-60%甲醇（1∶100）、HCl-70%甲醇（1∶100）、HCl-80%甲醇（1∶100）、HCl-90%甲醇（1∶100），按一定料液比浸泡 24 h，置于超声波清洗器中在一定功率、温度下提取，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加入一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。用HCl-70%甲醇提取盐酸小檗碱的提取率最高，说明黄柏中盐酸小檗碱在HCl-70%甲醇溶液中溶出度最大，故选择HCl-70%甲醇为提取溶剂。见表2。

表2 提取溶剂浓度对盐酸小檗碱提取率的影响（n=3）

2.2.4 料液比的选择 称取黄柏小片20.0 g，提取溶剂为 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比分别为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g ∶mL），浸泡 24 h，置于超声波清洗器中在一定功率、温度下提取，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加入一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。按照 “2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。在料液比 1∶10～1∶20范围内，提取率变化较快，当料液比超过1∶20时，盐酸小檗碱的提取率虽也有所增加，但增加较缓慢，为了节省溶剂及方便后续处理，故选择料液比为1∶20。见表3。

表3 料液比对盐酸小檗碱提取率的影响（n=3）

2.2.5 超声功率的选择 称取黄柏小片20.0 g，提取溶剂为 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比为 1∶20，浸泡24 h，超声功率分别为 100、250、400 W，在一定温度下提取，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。用超声功率250 W提取盐酸小檗碱提取率最高，当功率大于250 W，提取率会随之下降。这可能是由于超声提取过程中，随着功率的增大，超声波空化作用增强，产生的空化泡破碎越剧烈，有效成分提取率越高，但功率过高，有些目标成分结构可能会被破坏，并且非有效成分也会大量溶解到提取溶剂中，有效成分溶解量相对减少[11]。故选择250 W为超声提取功率。见表4。

表4 超声提取功率对小檗碱提取率的影响（n=3）

2.2.6 超声温度的选择 称取黄柏小片20.0 g，提取溶剂为 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比为 1∶20，浸泡24 h，超声功率250 W，超声温度分别为40、50、60、70℃提取，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加入一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。超声温度升高，盐酸小檗碱提取率也随之逐渐增大，当超声温度为60℃时提取率最大，但随着超声温度继续升高，提取率却有下降的趋势。这可能是由于超声温度过高会对溶出的盐酸小檗碱结构造成破坏，同时增大甲醇的挥发量，最终导致盐酸小檗碱提取率降低[12]，故选择60℃为提取温度。见表5。

表5 超声温度对盐酸小檗碱提取率的影响（n=3）

2.2.7 超声时间的选择 称取黄柏小片20.0 g，提取溶剂为 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比为 1∶20，浸泡 24 h，超声功率250 W，超声温度60℃，超声提取30、40、50、60 min，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加入一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。随着提取时间的延长，提取率也逐渐增加，但在50～60 min时增加幅度降低，故选择50 min为提取时间。见表6。

表6 超声时间对盐酸小檗碱提取率的影响（n=3）

2.2.8 提取次数的选择 称取黄柏小片20.0 g，提取溶剂为 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比为 1∶20，浸泡24 h，超声功率250 W，超声温度60℃，超声50 min，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，加一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析24 h，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末，为提取1次。然后将滤渣重复上述步骤进行2、3、4次提取。按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。提取次数为2次时，盐酸小檗碱提取率明显低于第1次，以后基本没有盐酸小檗碱提取出来，说明此方法适合于提取黄柏中盐酸小檗碱，且一次提取较完全。见表7。

表7 提取次数对盐酸小檗碱提取率的影响（n=3）

称取黄柏小片20.0 g，提取溶剂为HCl-70%甲醇（1∶100），料液比为 1∶20，浸泡 24 h，超声功率 250 W，超声温度60℃，超声50 min，趁热抽滤，滤液静置过夜。加入HCl调至pH=2，再加入一定浓度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%计算）搅拌，静置盐析 12、24、36、48 h，过滤，洗涤沉淀，干燥，得生物碱粉末。按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。随着盐析时间的延长，盐酸小檗碱的析出量逐渐增多，盐析36 h后小檗碱提取率趋于平缓，故选择36 h为盐析时间。见表8。

表8 盐析时间对小檗碱提取率的影响（n=3）

2.3 正交试验

以盐酸小檗碱提取率为考察指标，根据单因素试验结果，选择料液比（A）、超声功率（B）、超声时间（C）、超声温度（D）为主要考察因素，进行 L9（34）正交试验确定最佳工艺参数，正交试验设计及结果见表9，方差分析见表10。

由直观分析可知，各因素的重要性依次为A＞D＞C＞B。通过方差分析可知，4个因素中，A、D具有显着性影响（P＜0.05），C有影响但不显着。通过正交试验优化的黄柏中盐酸小檗碱最佳提取工艺为A2B2C3D2，即加入 20 倍量 HCl-70%甲醇（1∶100），超声功率250 W，50℃提取50 min。

表9 L9（34）正交试验设计及结果

表10 方差分析

2.4 最佳工艺验证试验

称取川黄柏20.0 g，平行3份，利用正交试验设计所优化的最佳工艺条件进行验证试验，测定最佳工艺条件下的盐酸小檗碱的含量，计算其提取率分别为8.214%、8.225%、8.209%，表明该提取工艺稳定可行。

3 讨论

本实验采用超声辅助提取川黄柏中盐酸小檗碱，其提取率在同样的实验条件下明显高于溶剂浸提法，此方法与文献报道基本符合[13-14]；通过正交试验多方面考察影响盐酸小檗碱提取工艺的各种因素，进行提取工艺的筛选，优化最佳提取工艺参数，实验结果表明，各因素的重要性依次为，料液比＞超声温度＞超声时间＞超声功率，盐酸小檗碱最佳提取工艺为，加入20 倍量 HCl-70%甲醇（1∶100），超声功率 250 W，50℃提取50 min通过采用HPLC法定量分析进行验证，测定的试验结果准确、可靠，确定的提取工艺条件合理、可行，为盐酸小檗碱的提取方法及其工业化生产提供了新手段。

[1]黄郑爽，周宁.关于黄柏种类的探讨[J].中草药，1999，30（8）：621-623.

[2]张冠英，董瑞娟，廉莲.川黄柏、关黄柏的化学成分及药理活性研究进展[J].沈阳药科大学学报，2012，29（10）：812-821.

[3]刘江亭，李慧芬，崔伟亮.川黄柏、关黄柏饮片和水煎液中3种生物碱含量的比较研究[J].山东中医药大学学报，2013，37（5）：437-441.

[4]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：287.

[5]董玉琼，何晓红，钟国跃.黄柏质量研究现状与问题探讨[J].现代中药研究与实践，2007，22（3）：58-60.

[6]李波，朱维良，陈凯先.小檗碱及其衍生物的研究进展[J].药学学报，2008，43（8）：773-787.

[7]秦梅颂.超声提取技术在中药中的研究进展[J].安徽农学通报，2010，16（13）：54-56.

[8]唐艳梅，叶萌，向丽，等.HPLC测定黄柏中的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱[J].华西药学杂志，2006，21（3）：265-267.

[9]谭生建，魏萍，刘刚，等.HPLC测定黄柏石膏散中盐酸巴马丁和盐酸小檗碱含量[J].中国药学杂志，2004，39（7）：546-547.

[10]廖海，周嘉裕，何成生，等.决明子大黄素和大黄酚的提取与含量测定[J].时珍国医国药，2007，18（6）：1332-1333.

[11]魏然，陈义伦，邹辉，等.超声波提取条件对国铃大枣多糖提取率的影响[J].食品与发酵工业，2013，39（11）：253-257.

[12]彭宗玢，朱天明.温度对盐酸小檗碱质量的影响[J].时珍国医国药，2002，13（10）：583.

[13]刘明言，王帮臣.用于中药提取的新技术进展[J].中草药，2010，41（2）：169-175.

[14]马帅，葛洁英，周蓬.HPLC法测定白带丸中芍药苷及盐酸小檗碱的含量[J].西部中医药 2015，34（7）：398-400.