唐 曦 杨 松 苟 博 吴少平 江 亮 刘 洪.成都医学院第一附属医院医学影像系，四川成都60500；.成都医学院校医院内科，四川成都60500
高脂喂养联合免疫损伤建立兔动脉粥样硬化模型及评价
唐曦1杨松1苟博1吴少平1江亮1刘洪2
1.成都医学院第一附属医院医学影像系，四川成都610500；2.成都医学院校医院内科，四川成都610500
目的利用高脂喂养联合免疫损伤建立兔实验性动脉粥样硬化模型，改进兔实验性动脉粥样硬化模型建立方法。方法选择雄性新西兰大白兔45只，分为三组。正常对照组（15只兔）给予饲普通饲料；高脂饲料模型组（15只兔）给予高脂饲料（88.5%普通饲料+7.5%蛋黄粉+6%胆固醇+4%猪油）；高脂饲料复合免疫损伤模型组（15只兔）喂养方式与高脂饲料模型组相同，并每周肌内注射胎牛血清蛋白，剂量250mg/kg。在喂养12周时，对每组兔进行血清采集、超声股动脉探查，解剖兔的主动脉并进行病理学HE染色检查，分析兔血脂Ⅰ指标、超声探查股动脉结果、兔主动脉粥样斑块、HE染色改变。结果与正常对照组比较，高脂饲料模型组、高脂饲料复合免疫损伤模型组兔血脂Ⅰ检测的生化指标总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平明显升高（P＜0.01）。高脂饲料复合免疫损伤模型组在大体解剖上显示粥样斑块病变较高脂饲料模型组、正常对照组明显增多；同时，超声检查股动脉表明，高脂饲料复合免疫损伤模型组血管病变较正常对照组和高脂饲料模型组明显。HE染色显示，高脂饲料复合免疫损伤模型组血管内皮下见更多吞噬脂质的泡沫细胞、淋巴细胞和纤维斑块形成。结论高脂喂养复合免疫损伤建立兔实验性动脉粥样硬化模型具有可行性，可更快速形成更成熟的动脉粥样硬化斑块。
动脉粥样硬化；免疫损伤；超声检查；高脂喂养
动脉粥样硬化是一组称为动脉硬化的血管病中最常见、最重要的一种，可累及冠状动脉、颈动脉、主动脉、肾动脉等大中动脉血管，并最终引发心、脑、肾血管疾病，而后者是老年人死亡的常见病因，因此加强对动脉粥样硬化的研究具有重要的临床价值，但实验研究最初的步骤即是要高效地建立动脉粥样硬化模型。各种动脉硬化的共同特点是动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。粥样硬化病变的形成是动脉对内膜损伤做出的炎症-纤维增生性反应的结果［1］。因此，模拟此病理过程建立兔动脉粥样硬化模型对疾病的实验研究具有重要的实用意义。本实验对比了高脂喂养、高脂喂养加免疫损伤建立动脉粥样硬化模型的效果，以期提高兔动脉粥样硬化模型的建立成功率。
1 对象与方法
1.1实验动物
纯种健康雄性新西兰大白兔45只，约2月龄，体重1.5～2.0 kg，由成都达硕生物科技有限公司提供［许可证号：SCXK（川）2013-14］。每只兔单笼适应性喂养普通兔颗粒饲料1周后，空腹12 h，耳缘静脉取血，测定血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，血脂水平差异大者不作为实验用兔。实验兔随机分组，分为正常对照组（15只）、高脂饲料模型组（15只）、高脂饲料复合免疫损伤模型组（15只）。每日观察动物的精神状态，进食、饮水及大小便情况，每周测体重，根据体重和进食情况及时调整给予饲料的总量。
1.2方法
1.2.1喂养方法及建模方法正常对照组饲普通饲料。高脂饲料模型组饲高脂饲料（88.5%普通饲料+7.5%蛋黄粉+1%胆固醇+3%猪油），蛋黄粉开始足量，胆固醇和猪油逐次增加（每次各增加0.5%），若兔子无腹泻，进食量可增加，约3 d加胆固醇和猪油1次，直至目标剂量（88.5%普通饲料+7.5%蛋黄粉+6%胆固醇+ 4%猪油）。高脂饲料复合免疫损伤模型组喂养方式与高脂饲料模型组相同，另外每周对该组兔子肌内注射胎牛血清蛋白，剂量为250mg/kg。三组兔子连续喂养12周。
1.2.2血脂Ⅰ号检测喂养满12周时，所有兔经腹腔麻醉满意后，经耳缘静脉取血，用全自动生化分析仪测定动物血脂Ⅰ号：TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。
1.2.3血管超声检查血管超声在适应性喂养结束时及喂养12周时分别对各组兔进行股动脉的探查，留下影像资料。
1.2.4大体解剖观察主动脉所有兔采用耳缘静脉注射过量水合氯醛处死，剖开胸腹腔，游离主动脉全长，剥离外膜脂肪组织，将主动脉从根部分离至股动脉，离断并纵行剖开，生理盐水冲洗干净，铺平摄像，观察并记录大体标本的情况。图像分析各组兔主动脉粥样硬化斑块面积。
1.2.5主动脉组织学标本取降主动脉粥样硬化斑块区的多块组织，保存于4%多聚甲醛溶液中，用于HE染色。应用倒置生物显微镜采集图像，采用Image-Pro Plus多媒体彩色病理图像分析软件进行半定量分析，经灰度变换将阳性染色与背景分开进行自动测量。
1.3统计学方法
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1三组兔血脂水平比较
饲养12周后取材，与正常对照组比较，其他两组兔血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平明显升高（P＜0.01）。见表1。
表1 三兔血脂水平比较（mmol/L，±s）
表1 三兔血脂水平比较（mmol/L，±s）
注：与正常对照组比较，*P＜0.01；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇
组别TG TC HDL-C LDL-C正常对照组（n=15）高脂饲料模型组（n=15）高脂饲料复合免疫损伤模型组（n=15）1.09±0.25 1.20±0.11*1.46±0.23*1.03±0.12 3.03±0.25*3.15±0.28*0.23±0.22 0.59±0.11*0.88±0.12*0.11±0.03 1.16±0.03*1.45±0.10*
2.2兔主动脉大体解剖形态
肉眼下，正常对照组主动脉内膜光滑，未见粥样硬化斑块；高脂饲料模型组主动脉内膜的粥样硬化斑块融合成片，密布内膜面，斑块面积比约为60%；高脂饲料复合免疫损伤模型组粥样斑块融合分布，斑块面积比约为75%，病变较正常对照组和高脂饲料模型组变化明显。见图1（封三）。
2.3 HE染色
正常对照组血管内皮下可见少许吞噬脂质的泡沫细胞；高脂饲料模型组血管内皮下可见较多吞噬脂质的泡沫细胞，其中见散在淋巴细胞和少量纤维斑块；高脂饲料复合免疫损伤模型组血管内皮下可见更多吞噬脂质的泡沫细胞，其中见散在淋巴细胞和大片状纤维斑块形成。见图2（封三）。
2.4兔股动脉超声探查情况
正常对照组股动脉超声检查未见粥样硬化斑块显像；高脂饲料模型组和高脂饲料复合免疫损伤模型组股动脉均可见粥样斑块显像，但高脂饲料复合免疫损伤模型组斑块体积更大。见图3（封三）。
3 讨论
3.1高脂饲料配制方法
在本次实验中，对于兔血脂的测定和饲喂饲料中猪油比例的控制对实验的成败有关键作用。本实验中，高脂饲料配制方法如下：先称取普通饲料的质量为A（占所配高脂饲料M的88.5%），然后算出高脂饲料的质量M（M=A/88.5%），接着按照目标剂量再配制蛋黄粉（7.5%M）、胆固醇（6%M）、猪油（4%M），然后称取并配制高脂饲料。兔对外源性胆同醇吸收率高（75%～90%），采用少量、多次添加饲料饲喂的方式较好，因而应注意配制的饲料中胆固醇及其所占比例。如果饲料中没有添加胆固醇或者是胆固醇所占比例过少，不易在短时间内成功建立动脉粥样硬化模型［2-3］。相反，如果胆固醇比例过大，有学者［4］在高脂饲料中添加胆固醇比例高达30%，虽然缩短了造模时间，但易造成兔腹泻，死亡率增加，而且造模成功后的兔极易死亡。相关学者研究亦发现应用高脂饲料法2～4个月可建立动脉粥样硬化模型［5］。
3.2大体解剖及病理学观察的对比结果
本实验发现，高脂饲料模型组、高脂饲料复合免疫损伤模型组与正常对照组相比，动脉粥样硬化斑块主要累及胸、腹主动脉，主动脉分支受累较轻，高脂饲料复合免疫损伤模型组可见斑块环绕管腔大部，且较单纯性高脂饲料模型组的硬化斑块密集、分布范围广。主动脉HE染色显示，高脂饲料复合免疫损伤模型组斑块更成熟，表现为明显的脂纹、粥样斑块和纤维斑块形成，内膜下可见纤维组织，平滑肌细胞排列紊乱等，这与相关研究具有相似处［6-8］。注射异体血清蛋白（胎牛血清）诱发了兔血清反应导致兔动脉内膜损伤，促进了泡沫细胞灶的形成和脂质沉积，并促使脂质向动脉壁转运，促进了兔动脉粥样硬化的发生和发展。高脂饲料复合免疫损伤模型组能在较短时期内复制出稳定的实验兔动脉粥样硬化斑块模型，其主动脉局部病理特点与人类动脉粥样硬化病理特点非常相似。单纯高脂饲料模型组的脂质沉积和纤维增生的程度较轻。
3.3血脂检测的分析
脂代谢紊乱不仅影响正常的生理功能，还会导致动脉粥样硬化、高脂血症等疾病，并与高血压、糖尿病等一系列心脑血管疾病的发生发展有着密切的联系［9］，严重危害人类健康。有研究表明高，TC是冠心病的主要危险因素。TG不是冠心病的独立危险因素，但高TG如合并有糖尿病、肾病综合征等代谢疾病时，易诱发胰腺炎。HDL-C是肝脏和小肠合成的脂蛋白，它运输内源性胆固醇到肝脏处理，具有抗动脉粥样硬化形成和抑制免疫炎症反应的作用［10］，它也是预测冠心病的重要因素之一。LDL-C是携带胆固醇的主要颗粒，它可直接将胆固醇转运到组织和细胞内，是动脉粥样硬化的主要危险因素。美国国家胆固醇教育计划成人治疗专业组规定将LDL-C的水平作为高脂蛋白血症治疗决策及其需要达到的治疗目标。相关研究表明，LDL-C中含有大量的TC和胆固醇酯，可与动脉壁蛋白多糖结合产生不溶性沉淀，并促使纤维组织增生，使动脉壁增厚［11］。相关研究指出，血脂代谢异常血清中TG、TC和LDL-C的升高是诱发动脉粥样硬化的首要因素之一，也是动脉粥样硬化主要危险因素之一［12-15］。有学者认为，LDL-C/HDL-C比值是反映动脉粥样硬化程度最好的指标，LDL-C、HDL-C有可能处于正常值范围但其比例可能已变化，血脂比值能更早反映动脉粥样硬化的发生，因此在评价动脉粥样硬化的发生时可利用比值来进行观察［16-17］。本实验兔喂养到第12周时，正常对照组血脂水平未见明显异常，高脂饲料模型组、高脂饲料复合免疫损伤模型组血脂水平较正常对照组明显增高，说明高脂喂养能建立动脉粥样硬化模型。
3.4超声检测的分析
喂养到第12周时，正常对照组兔股动脉超声探查均未见明显异常，而高脂饲料模型组、高脂饲料复合免疫损伤模型组较正常对照组均见明显异常，高脂饲料复合免疫损伤模型组较高脂饲料模型组股动脉超声异常明显。颈动脉粥样硬化斑块容易发生在分叉部，因为该区血流易产生涡流，对血管壁的冲击力加大，因此在超声对动脉粥样硬化斑块检测时要多注意分叉处。虞旭东等［18］研究显示，股动脉斑块对研究动脉粥样硬化的准确度高于颈动脉斑块。通过本实验的超声检查发现兔肠道冗长，结肠粗大，肠内积气明显，经腹前壁进行观察腹主动脉时易受气体影像，观察肠道后方的腹主动脉效果差。兔肋骨排列密集，由后上方向前下方走行的倾斜度大，超声难避开胸骨和肋骨的骨质影响，因此超声对后纵隔胸主动脉的观察效果差。兔颈部较短，超声探头放置和扫查进行移动和进行扇形扫描时有困难。兔股动脉位置表浅，股部内侧组织较平坦，超声探头在此部位进行扫查较容易，图像较清晰。在人类动脉粥样硬化的超声检查中，动脉内膜中层厚度测定是超声检查的首选定量检测方法，但兔的动脉各层次结构在本实验的超声检测中难进行区别，所以针对兔的动脉形态学观察主要是对血管壁的厚度、管腔内径和管壁情况进行了检测。目前超声新技术如脉搏波传导速度、血管回声跟踪技术、速度向量成像技术及二维应变技术、超声弹性成像、超声射频数据处理和分子成像等可检测动脉功能，且数据的异常早于动脉形态学改变，对动脉疾病的早期诊断具有重要意义。但新技术缺乏统一的测量及诊断标准，因此新技术在血管疾病中的诊断作用将是后期的研究方向。
本实验使用高脂喂养联合免疫损伤建模方式，能较好模拟人类动脉粥样硬化疾病的炎性和内膜脂质沉积纤维增生等改变，动物死亡率低，动脉粥样硬化模型成功率高。因此，高脂喂养联合免疫损伤是一种成本低、成功率高的动脉粥样硬化建模方法。
［1］周涛，范忠才.血管内皮细胞与动脉粥样硬化的关系［J］.现代医药卫生，2016，32（5）：708-710.
［2］符凌，常小荣，岳增辉，等.免疫损伤——高脂喂养法建立兔动脉粥样硬化模型的方法与体会［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（7）：853-854.
［3］邵晓军，王海萍，张晨.免疫损伤-高脂喂养法建立兔动脉粥样硬化模型评价［J］.齐鲁医学杂志，2009，24（3）：264-266.
［4］张勇，娄桂予，钱民章.建立兔高脂血症模型及动脉粥样硬化斑块的方法［J］.遵义医学院学报，2001，24（4）：304-306.
［5］刘五州，妥海燕，吴国泰.家兔高脂血症和动脉粥样硬化模型研究进展［J］.甘肃中医药大学学报，2016，33（1）：79-82.
［6］Goldschmidt-clermont PJ，Creager MA，Losordo DW，et al. Atherosclerosis 2005：recent discoveries and novel hypotheses［J］.Circulation，2005，112（21）：3348-3353.
［7］Keaney JF.Atherosclerosis from lesion formation to plaque activation and endothelial dysfunction［J］.Mol Aspects of Med，2000，21（4-5）：99-166.
［8］何新群，岳增辉，常小荣.动脉粥样硬化兔模型的建立及评价［J］.湖南中医药大学报.2010，30（9）：27-29.
［9］邓慧君.茶中多酚类化合物影响脂质代谢作用分子机制的比较研究［D］.长沙：中南大学，2006.
［10］李靓，谢巍，姜志胜.我国动脉粥样硬化基础研究近三年进展［J］.中国动脉硬化杂志，2015，23（11）：1182-1186.
［11］丁毅.颈动脉粥样硬化与血脂LDL/HDL-C及ApoB/ApoA1的关系［J］.河北医学，2013，19（2）：212-214.
［12］张军平，许颖智，李良军，等.实验性动脉粥样硬化模型复合建模的方法及评价［J］.中国比较医学杂志，2009，19（1）：41-45.
［13］徐仁艳.颈部血管彩超对动脉粥样硬化引起缺血性脑血管病评价的临床作用［J］.中国医药科学，2014，4（21）：111-113.
［14］郭媛媛，王点，李悠.基于脂代谢特点建立豚鼠动脉粥样硬化模型优势的研究进展［J］.现代生物医学进展，2015，15（34）：6788-6791.
［15］谭文亮，区文财，罗义，等.超声造影对冠心病颈动脉粥样硬化斑块新生微血管的评价［J］.中国医药科学，2015，5（13）：162-164.
［16］何光朝，郭纪群，葛均波.血脂各成分及其比值与冠状动脉粥样硬化程度的关系［J］.中华临床医师杂志：电子版，2013，7（16）：7427-7431.
［17］李建聪，周丽欢，刘健烽，等.彩超在高血压患者颈动脉粥样硬化的诊断价值探析［J］.中国医药科学，2014，4（20）：64-65.
［18］虞旭东，傅国胜，鲍晓锋，等.颈、股动脉粥样硬化超声标识与冠心病的关系研究［J］.临床心血管病杂志，2006，22（8）：490-492.
Establishment and evaluation of rabbit atherosclerosis model associated w ith high fat feeding and imm une injury
TANG Xi1YANG Song1GOU Bo1WU Shaoping1JIANG Liang1LIU Hong2
1.Department of Medical Imageology，the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Sichuan Province，Chengdu 610500，China；2.Department of Internal Medicine，Hospital of Chengdu Medical College，Sichuan Province，Chengdu 610500，China
Ob jective To establish the experimental rabbit atherosclerosis plaque formation model by high fat feeding and immune injury，in order to improve the rabbit experimental atherosclerosismodel.M ethods 45 male New Zealand white rabbitswere randomly divided into three groups.Normal control group（15 rabbits）was given ordinary feed；the high fat dietmodel group（15 rabbits）was given high fat forage（88.5%ordinary feed+7.5%egg yolk powder+6% cholesterol+4%lard）；the high-fat diet combined immune injury group（15 rabbits）was fed the same as high fat feedingmodel group，while rabbitswere given intramuscular injection of fetal bovine serum protein（250 mg/kg）per week. Rabbit serum was collected for lipidⅠindexes detection and femoral artery was probed with ultrasound for atherosclerotic aortic plaque detection at 12 weeks of feeding，then the rabbit aorta was taken out for pathological analysis by HE staining.Resu lts Compared to normal control group，high fat dietmodel group and high fat diet combined immune injury model group increased significantly in serum biochemical indicators of total cholesterol，triglyceride，high density lipoprotein cholesterol，and low density lipoprotein cholesterol（P＜0.01）.The high fat diet combined immune injury model group showed larger pathological morphology compared with the high fat dietmodel group and normal control group，meanwhile femoral artery ultrasound showed more significant difference of lesions compared with the high fat dietmodel group and the normal control group.HE staining showed that，the high fat diet combined immune injury model group had more lipid foam cells，lymphocytes and fiberpatches formation in subcutaneous tissue.Conclusion The establishment of high fat diet combined immune injury model is feasible，withmoremature formation of atherosclerotic plaque.
Atherosclerosis；Immune injury；Ultrasonography；High fat feeding
R543
A
1673-7210（2016）06（c）-0021-04
四川省卫生厅科研课题资助项目（120472）；四川省教育厅科研课题资助项目（15ZB0251）；成都医学院大学生创新实验计划项目（CXJS201314，CXJS201317）。
唐曦（1981-），女，硕士；研究方向：骨关节系统、心血管系统影像诊断。
刘洪（1981-），男，汉族，四川遂宁人，医学硕士，副主任医师，主要从事心血管疾病的基础与临床研究。
（2016-02-26本文编辑：程铭）
