陈都红 陈少秀 王超
[摘要] 目的 建立Balb/c裸小鼠寻常型银屑病动物模型，观察银屑平对其表皮组织中双调蛋白（AREG）、血管内皮生长因子（VEGF）及角质形成细胞生长因子（KGF）的影响。 方法 Balb/c裸小鼠36只，随机分为模型对照组和银屑平A组、银屑平B组，三组均连续8 d于小鼠头颈部、上肢、躯干和下肢4个部位皮肤涂咪喹莫特软膏的方法建模。末次给药造模第8天，银屑平A、B组按0.1 g/kg和0.5 g/kg剂量灌胃治疗10 d，模型对照组灌等量生理盐水。于造模第8天和治疗第10天，采用皮损面积和严重程度指数（PASI）对动物头颈部、上肢、躯干和下肢4个部位皮肤病变情况进行评分；ELISA法定量测定表皮组织匀浆液中AREG、KGF、VEGF和血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）等指标含量。 结果 银屑平A组、银屑平B组和模型对照组造模第8天PASI评分比较，差异无统计学意义（P > 0.05），灌胃治疗第10天时，银屑平A组、银屑平B组PASI评分均较模型对照组和同组造模第8天明显降低（P < 0.05），表皮组织匀浆液中AREG、KGF、VEGF和VEGFR1均低表达（P < 0.05）。银屑平A组、银屑平B组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 银屑平可能通过降低表皮组织匀浆液中AREG、KGF、VEGF含量，并有可能阻断VEGF与和VEGFR1结合，这对抑制表皮病变细胞角化和皮下组织血管新生，减轻受试动物银屑病样病理改变有肯定的干预作用。
[关键词] 寻常型银屑病；银屑平；双调蛋白；血管内皮生长因子；角质形成细胞生长因子
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（a）-0021-04
[Abstract] Objective To establish animal models of Balb/c nude mice with psoriasis vulgaris， observe the effect of Yinxieping on double adjustable epidermal tissue protein （AREG）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and keratinocyte growth factor （KGF）. Methods 36 Balb/c nude mice were randomly divided into model control group and Yinxieping A group， Yinxieping B group， the three groups were all smeared imiquimod cream for consecutive 8 d in skin of 4 sections in head and neck， upper limbs， torso and lower extremities of mice to built the model. At the dose of 8th day after modeling， Yinxieping A group， Yinxieping B group were treated by gavage for 10 d with 0.1 g/kg and 0.5 g/kg dose， model group was injected into the same amounts saline. At the treatments 8th， 10th day， psoriasis area and severity index （PASI） was used to evaluated the animal head neck， upper limbs， torso and lower extremities 4 skin lesions； ELISA was uesd to determine contents of AREG， KGF， VEGF and vascular endothelial growth factor receptor 1 （VEGFR1） and other indicators in epidermal tissue homogenates in a fixed quantity. Results PASI scores of Yinxieping A group， Yinxieping B group and model control group at modeled 8th day were compared， the differences were not statistically significant （P > 0.05）， when treated by gavage at 10th day， compared with the model control group and themsavies at modeled 8th day， PASI scores of Yinxieping A group， Yinxieping B group decreased significantly （P < 0.05）， the expression of AREG， KGF， VEGF and VEGFR1 in epidermal tissue homogenates was lower （P > 0.05）. Yinxieping A group and Yinxieping B group were compared， the differences were not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Yinxieping can decrease contents of AREG， KGF， VEGF in epidermal tissue homogenate， and it may block the combination of VEGF and VEGFR1， which has positive effects in the inhibition of epidermal keratinocyte lesions and subcutaneous tissue angiogenesis， reducing the subjects change in animal with psoriasis to play parts in pathological intervention.
[Key words] Psoriasis vulgaris； Yinxieping； Amphiregulin； Vascular endothelial growth factor； Keratinocyte growth factor
双调蛋白（AREG）是与血管内皮生长因子（VEGF）同源的穿膜糖蛋白，其分子C端有相似的表皮生长因子结构，可刺激人成纤维细胞和肿瘤细胞的增殖，两者在正常上皮组织均中低表达，但寻常型银屑病表皮组织中则高表达[1]。在皮肤发育过程中，表皮发育基因角质形成细胞生长因子（KGF）具有促进表皮细胞分化作用，其分泌保持在相对稳定水平，对抑制上皮细胞有丝分裂、维持表皮功能具有重要作用，在寻常型银屑病病理改变时KGF会出现过度分泌造成表皮过度角化或角化不全的现象[2]。在对寻常型银屑病的实验研究中，人们往往局限于以T淋巴细胞介导的炎性反应或表皮细胞因子VEGF过度表达而忽视了AREG和KGF在寻常型银屑病中的重要环节。银屑平现已广泛用于治疗银屑病，目前研究证实其对银屑病表皮组织VEGF、白细胞介素（IL）-8、IL-17、IL-23等有调节作用[3-4]。但对AREG和KGF的表达缺少相关研究，本文重点研究了以上多因素的相互作用，以期为寻常型银屑病病理改变和治疗发掘新的理论凭据和实验方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Balb/c裸小鼠36只，体重（18～22）g，采用随机数字表编号随机分为模型对照组和银屑平A、B组（n = 12），实验过程在十堰市太和医院科研中心的标准实验室完成，实验动物合格证号：SYXK（鄂）2016-0031。
1.2 药品及试剂
银屑平（山西华元医药生物技术有限公司，规格：0.24 g/片，批号：A1400012047）；咪喹莫特软膏（珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，批号：B14200158 270）；VEGF和VEGFR1酶联反应ELISA试剂盒（上海浩然生物技术有限公司，批号：400-31-2、400-31-10）；KGF和AREG酶联反应ELISA试剂盒（上海高创化学科技有限公司，批号：CSB-E04497、cyt-041）。
1.3造模及治疗
将咪喹莫特软膏均匀涂于小鼠头颈部、上肢、躯干和下肢4个部位皮肤，软膏涂抹厚1 mm、直径1 cm，三组均连续8 d。8 d后头颈部、上肢、躯干和下肢4个部位出现红斑、鳞屑、乳头瘤样增生、角化过度、局灶性角化不良、病理出现棘层肥厚和淋巴细胞浸润等银屑病样皮损变化为成模标准[5]。本实验成功率为100%，造模8 d后所有动物均符合以上银屑病成模标准。三组治疗方法：于末次涂药第8天，将银屑平研碎后配制成10%的混悬液备用。末次涂药造模后，银屑平A组、银屑平B组按0.1 g/kg和0.5 g/kg剂量灌胃1次/d，治疗10 d，模型对照组灌等量生理盐水。
1.4 皮损面积和严重程度指数（PASI）
评分方法：计算裸鼠头颈部、上肢、躯干和下肢4个部位PASI分值。皮损面积评分为4个体部位，分别以0～6分。面积：0 = 无皮疹；1<10%；2 = 10%～29%； 3 = 30%～49%；4 = 50%～69%；5=70%～89%；6 = 90%～100%；躯干部位：头面=10%、躯干=30%、上肢=20%、下肢=40%：以上4个部位分别进行皮损面积评分。皮损严重程度：红斑；浸润；鳞屑。浸润（infiltration，I）：皮损向四周扩散蔓延的趋势，边界模糊不清，压之有实质感；表皮脱屑/鳞屑（desquamation，D）：指脱落的表皮细胞成片剥落；红斑（erythema，E）：红色或暗红色炎症性斑，压之退色；I、D、E用0～4分评价：0=无；1=轻度；2=中度；3=重度；4=极重度。根据以上计分再计算PASI总分。PASI=（E头+I头+D头）×A头×0.1+（E上肢+I上肢+D上肢）×A上肢×0.2+（E躯干+I躯干+D躯干）×A躯干×0.3+（E下肢+I下肢+D下肢）×A下肢×0.4，PASI分值越高代表皮损严重程度越严重[6-7]。
1.5实验观察指标及检测方法
三组小鼠于造模第8天时和治疗第10天，每组各处死6只，取背部皮肤研磨匀浆，然后3000转离心10 min，取上清液，ELISA法检测匀浆液中AREG、KGF、VEGF和VEGFR1含量[8]。
1.6 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1小鼠皮损情况观察
造模前所有小鼠均无银屑病样病变发生，模型对照组和银屑平A组、银屑平B组在造模第8天，头颈部、上肢、躯干和下肢4个部位均出现红斑、鳞屑、乳头瘤样增生、角化过度、局灶性角化不良现象。病理检查其表皮出现棘层肥厚和淋巴细胞浸润等银屑病样皮损病理改变，小鼠背部涂药皮肤表皮角质层出现过度角化现象，钉突延长、棘层变厚，真皮层出现炎细胞浸润反应，说明用咪喹莫特软膏涂小鼠皮肤造模是成功的。在治疗第10天，模型对照组有3只小鼠表皮有病变加重现象，而银屑平A组、银屑平B组皮损消失，无角化、红斑、鳞屑、乳头瘤样增生现象，表皮钉突完全消退。
2.2 银屑平对小鼠PASI、AREG和KGF的影响
治疗第10天，模型对照组PASI、AREG和KGF与同组造模第8天比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；银屑平A组、银屑平B组治疗第10天明显降低，与模型对照组和同组治疗比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。银屑平A组、银屑平B组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
2.3 银屑平对小鼠VEGF和VEGFR1的影响
模型对照组VEGF和VEGF1治疗第10天与同组造模第8天比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；银屑平A组、银屑平B组治疗第10天明显降低，与模型对照组和同组治疗比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。银屑平A组、银屑平B组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。如表2。
3 讨论
寻常型银屑病属于“松皮癣”“白疕”“干癣”等范畴，多从血论证辩证施治，以血瘀、血燥、血热辨证分型，治疗时以活血、养血、凉血为主[9-10]。该病具有泛发性、易复发性和顽固性特征[11-12]。银屑平具有疏通气血、软坚消积、清热解毒、燥湿杀虫、凉血养阴之功效，临床用于治疗银屑病[13]。
观察发现，银屑平A组、银屑平B组小鼠在治疗第10天时，小鼠皮肤组织中AREG、KGF、VEGF和VEGFR1均明显低于模型对照组和同组造模第8天，小鼠头颈部、上肢、躯干和下肢4个部位涂药处皮损组织基本消退。这说明白银屑平可能阻断VEGF与和VEGFR1结合，并通过抑制表皮病变细胞角化和皮下组织血管新生来减轻受试动物银屑病样病理改变，这可能是治疗寻常型银屑病重要途径之一。研究表明，VEGF可促进寻常型银屑病病变皮损处组织血管新生，其受体VEGFL在皮肤组织中表达也会明显增强，这可能激活真皮乳头微血管的内皮细胞而促进自身的生长而加重寻常型银屑病病理改变[14]。AREG可刺激人成纤维细胞和肿瘤细胞的增殖，在寻常型银屑病表皮组织中高表达[15]。KGF在皮肤角化不全和过度增殖等形态学改变的过程中发挥重要作用，KGF主要来源于T细胞和成纤维细胞，募集在表皮组织中的T淋巴细胞在活化后会刺激成纤维细胞不断产生KGF，造成表皮细胞角质过度增殖[16]。由于寻常型银屑病发病多以风热、风寒、寒温、湿热、燥毒之邪侵袭肌肤有关，且患者多因为禀赋先天不足，情志内伤导致气血运行受阻、内外合邪而致血瘀，瘀血内停，瘀久化热，瘀热互结，搏于气血而致病[17-18]。“血瘀、血热和血燥”贯穿于疾病的发展全过程，故中医治疗多强调“凉血养阴”为主，兼以“活血解毒”为辅，银屑平丸就是根据这一治疗原则研制而出的纯中药制剂[19]。在本实验中，模型对照组AREG、KGF、VEGF和VEGFR1等指标异常升高，而银屑平可以明显降低银屑病样小鼠模型皮肤组织中的含量，此结果提示银屑平丸可能是通过抑制以上指标而达到治疗银屑病的目的。分析认为，这与本方中生地黄、半枝莲、大青叶、白花蛇舌专清热凉血解毒养阴、清热解毒有关。针对本病的热瘀病机，方中牡丹皮、紫草、赤芍、丹参具有清热凉血、活血化斑的作用。而白鲜皮以皮达皮、清热祛风止痒，女贞子、旱莲草养阴生津，助生地加强滋阴之效，甘草清热解毒兼调和诸药，又可顾护脾胃，本方清热之中兼以养阴、凉血与活血散瘀配伍并用，共奏清热解毒、凉血散瘀、养阴生津之功[20]。
综上所述，银屑平可能通过抑制VEGF与VEGFR1结合来减少皮损部位的血管增生，同时，可能通过抑制与VEGF同源的细胞因子AREG的分泌来减少成纤维细胞和肿瘤细胞的增殖，使KGF介导的表皮细胞过度角化现象减轻，从而达到治疗寻常型银屑病的目的。
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（收稿日期：2017-04-11 本文编辑：苏 畅）
