赵 磊 李 琼

安徽省芜湖市中医医院药剂科，安徽芜湖 241000

由糖尿病联盟最新指南可知，全球约有4.63 亿糖尿病患者，我国的患者数居全球首位，并呈不断增长趋势；同时老龄化的形势加剧，老年糖尿病患者数也是全球最多的国家[1]。糖尿病肾病的患病率与年龄、病程、血压、血脂等呈正相关[2-3]，老年患者疾病比较复杂，多合并其他各种慢性疾病，因自身特点，患糖尿病肾病的风险因素较高，有20%～40%的患者合并糖尿病肾病，而糖尿病肾病是终末期肾病的主要原因[4]，对于糖尿病肾病防治方案的研究更加紧迫。随着中医药技术的发展，近年来传统中医药因标本兼治和低毒副作用的优点，使其在肾病治疗领域广受推崇。尿毒清颗粒是纯中药制剂，由黄芪、苦参、制何首乌、大黄、车前草、丹参、白芍等中药组成。其中大黄、黄芪、川芎和丹参同为君药，活血祛瘀；制何首乌甘补、增益精血，与白术、党参、茯苓共为臣药；白芍与车前草、柴胡、制半夏、菊花为佐药，养血止痛；甘草作为使药。该组方对于慢性肾衰竭及糖尿病并发症等均有良好的治疗作用[5-8]。经查阅相关文献[9-13]，大黄酸、苦参碱、黄芪甲苷、芍药苷、丹参素及原儿茶醛的测定均有报道，但是对于制何首乌和丹参中重要的活性成分2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（简称“二苯乙烯苷”）和丹酚酸B 没有报道。为保证该制剂的内在质量，本研究改进了芍药苷的测定方法，采用高效液相色谱法对白芍中的芍药苷、制何首乌中的二苯乙烯苷、丹参中的丹酚酸B 同时进行含量测定，建立了质量控制方法，为该药的安全性和有效性提供实验依据。

1 仪器与试药

安捷伦1200 高效液相色谱仪；XP-205 分析天平（精度为0.01 mg，Mettler-toledo）；UPS-11-10T 超纯水器（成都优普净化科技）。

乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，购于芜湖市欣志化玻仪器销售有限公司；自制高纯水；对照品：芍药苷（110736-201640，99.05%），二苯乙烯苷（121190-201204，91.0%），丹酚酸B（121190-201204，94.1%）购于中国食品药品检定研究院；尿毒清颗粒（20190105、20201106、20200705、20200105）购于内蒙古康臣药业；黄芪（210301）购于芜湖振龙齐欣药业有限公司；苦参（201001）购于安徽致良中药饮片有限公司；制何首乌（201102）购于安徽致良中药饮片有限公司；大黄（2200712T）购于杭州民泰（亳州）中药饮片有限公司；茯苓（210106）购于亳州市善安堂中药饮片有限公司；桑白皮（E200801）购于安徽徽草堂药业饮片股份有限公司；车前草（200801）购于亳州市京皖中药饮片厂；丹参（2201221X）购于杭州民泰（亳州）中药饮片有限公司；白芍（201101）购于安徽敬道生物科技有限公司；党参（210601）购于芜湖振龙齐欣药业有限公司；制半夏（D201201）购于安徽致良中药饮片有限公司；柴胡（201201）购于亳州市慈济堂中药饮片有限公司；菊花（201002）购于安徽致良中药饮片有限公司；甘草（210320）购于亳州市善安堂中药饮片有限公司；川芎（E210401）购于安徽徽草堂药业饮片股份有限公司；实验用药材经安徽省芜湖市中医医院中药库鉴定为正品药材。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脱（0～14 min，19%乙腈；14～15 min，19%→26%乙腈；15～30 min，26%乙腈）；流速1.0 ml/min；检测波长：0～7 min，230 nm；7～30 min，320 nm；进样量：10 μl；理论塔板数以二苯乙烯苷计，不得＜3000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液 精密称取芍药苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 适量；以50%甲醇充分溶解定容至一定体积，制成浓度分别为249.61、123.76、248.42 μg/ml 的混合储备液。

2.2.2 对照品溶液 取上述储备液精密稀释一定倍数，制成芍药苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 系列浓度的溶液。芍药苷系列浓度为24.96、49.92、99.84、149.76、199.68、249.61 μg/ml；二苯乙烯苷系列浓度为12.38、24.75、49.50、74.26、99.01、123.76 μg/ml；丹酚酸B 系列浓度为24.84、49.68、99.37、149.05、198.74、248.42 μg/ml。

2.2.3 供试品溶液 取尿毒清颗粒2 袋（20190105），约10 g，于研钵中研细；精密称定2 g，量取适量的50%甲醇，超声处理（350 kW，40 kHz）30 min，放冷，滤至50 ml 的容量瓶中，定容；震荡混匀，静置，过针式有机滤膜，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性供试品溶液 按处方去除白芍、何首乌和丹参外的药材投料，根据工艺制成缺白芍、何首乌和丹参的阴性供试品，再按“2.2.3”项下制备阴性供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验 取“2.2.2”项下芍药苷（99.84 μg/ml）、二苯乙烯苷（49.50 μg/ml）、丹酚酸B（99.37 μg/ml）对照品溶液、“2.2.3”项下供试品溶液和“2.2.4”项下阴性供试品溶液；依据“2.1”项下色谱条件检测峰面积，结果见图1。供试品中3 个指标成分的分离度均＞1.5；理论塔板数以二苯乙烯苷计，≥3000；同时阴性供试品在3 个指标成分的相应位置上无干扰峰。

2.3.2 线性关系 取“2.2.2”项对照品溶液，依据“2.1”项下色谱条件检测峰面积；以混合对照品浓度对峰面积作图，提示芍药苷在24.96～249.61 μg/ml、二苯乙烯苷在12.38～123.76 μg/ml、丹酚酸B 在24.84～248.42 μg/ml 线性关系良好。见表1。

表1 线性关系方程

2.3.3 精密度 取“2.2.2”项下芍药苷（49.92 μg/ml）、二苯乙烯苷（24.75 μg/ml）、丹酚酸B（49.68 μg/ml）对照品溶液10 μl，依据“2.1”项下色谱条件检测峰面积。结果显示，芍药苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 峰面积的RSD 值分别为0.9%、1.8%、1.1%，表明精密度良好。

2.3.4 稳定性 取已制备的同一供试品溶液，于室温下，在0、4、8、12、18、24 h 分别进样，测定3 个指标成分在各时间点的峰面积，计算各自的峰面积RSD 值。结果显示，芍药苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 峰面积的RSD 值均＜2.0%，说明样品在室温储藏条件下24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性 取尿毒清颗粒（20190105），按照“2.2.3”项下平行制备6 份供试品，依据“2.1”项下色谱条件检测峰面积，根据外标法分别计算3 个指标成分的平均含量以及RSD 值。结果显示，芍药苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 平均含量分别为1.68、0.82、1.92 mg/g；峰面积的RSD 值分别为0.8%、0.5%、1.1%，提示重复性良好。

2.3.6 加样回收率 取尿毒清颗粒（20190105）10 g，研细，过四号筛，精密称取6 份，每份1 g，依序精密加入约与含量等量的干燥对照品，按“2.2.3”项下方法制备；依据“2.1”项下色谱条件检测峰面积，计算加样回收率。结果显示，芍药苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 平均加样回收率分别为100.21%、100.62%、99.87%；峰面积的RSD 值分别为1.14%、0.58%、0.91%。见表2。

表2 加样回收率

2.4 不同批次样品测定结果

精密称取3 批尿毒清颗粒内容物（20201106、20200705、20200105）2 g，每批平行两份，按照“2.2.2”项下方法制备，“2.1”项下色谱条件检测峰面积，通过外标法计算3 个指标成分的含量。见表3。

表3 不同批次样品测定结果（mg/g）

3 讨论

本研究通过紫外光扫描选择了230、320 nm 的波长分段检测。针对提取溶剂，考察了50%甲醇和稀乙醇对于含量的提取效率，结果表明稀乙醇与50%甲醇的提取效率接近，但二苯乙烯苷的提取率不如50%甲醇，且杂质干扰变多，因此，选择50%甲醇作为提取溶剂。

尿毒清颗粒中作用于慢性肾脏病靶点基因多，活性成分多，其中以丹参最多[14]。该制剂为水溶性口服制剂，芍药苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 在提取的水溶性部位均有良好的呈现[15-17]，故考虑这3 个成分作为指标物，以保障该制剂的有效性，提高了质控手段，降低了实验成本，经济性良好。二苯乙烯苷作用广泛，通过干预基因表达，减轻肾脏损伤；调节内分泌，保护肾小管肾脏[18-20]。丹酚酸B 可以改善肾纤维化，通过上调部分转录因子表达保护肾脏，对肾病综合征有积极的治疗作用[21-24]。芍药苷也能通过抑制糖尿病肾病各通路以及靶点，达到保护肾脏的作用[25-26]。尿毒清颗粒对于肾病的治疗效果是否由这3 种成分起关键性作用还有待于进一步的研究论证。