许 杰 王 晖 温 洪 张 舰

首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科，北京 100020

脑卒中是最常见的临床脑血管疾病之一[1]。缺血性脑卒中可导致脑损伤和神经功能障碍[2]。脑缺血/再灌注虽可挽救死亡细胞，但也可能加重细胞损伤[3]。因此，有必要探究影响脑卒中进程的病理机制，寻找缓解脑缺血/再灌注损伤的有效策略。目前，缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）诱导的大鼠PC12 细胞已经被广泛用于模拟脑卒中体外模型[4]，这为开展脑卒中的相关研究提供了方便。异丙酚是一种高脂溶性麻醉药物[5]，被发现可缓解缺血/再灌注诱导的脑损伤[6]。此外，异丙酚被证实可改善神经炎症损伤，并可能作为脑卒中神经保护的有效策略[7-8]。因此，揭示异丙酚调控脑卒中进程的分子机制至关重要。微RNA（microRNA，miRNA）是脑卒中进程的关键调控子。研究显示，miR-1246 在缺血性脑卒中患者血清中高表达[9]。然而，异丙酚是否通过影响miR-1246 表达调控脑卒中进程尚不清楚。因此，本实验研究异丙酚是否通过调控miR-1246 表达影响H/R 诱导的PC12 细胞损伤，为脑卒中的治疗提供潜在分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

PC12 细胞（货号：CL-0412）购自中国武汉procell；异丙酚（货号：2078-54-8）购自Sigma-Aldrich；DMEM 培养基（货号：11965092）、胎牛血清（货号：10100147）购自Gibco；Lipofectamine3000（货号：L300-0075）、Trizol 试剂（货号：15596026）购自Invitrogen；逆转录（货号：RR047A）和荧光定量试剂盒（货号：DRR041A）购自TaKaRa；RIPA 裂解液（货号：P0013B）、BCA 试剂盒（货号：P0012S）、MTT试剂盒（货号：C0009S）、Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（货号：C1062S）购自上海碧云天生物技术有限公司；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）试剂盒（货号：ml002813、ml028514、ml002859、ml028510）购自上海酶联生物科技有限公司；miR-1246 模拟物及抑制剂（miR-1246 和anti-miR-1246）购自上海吉玛制药技术有限公司；B 淋巴细胞瘤-2（B lymphocyte-2，Bcl-2）抗体（货号：ab32124）、B 淋巴细胞瘤-2关联x 蛋白（B lympho-blastoma-2 associated with x protein，Bax）抗体（ab32503）、GAPDH 抗 体（货 号：ab9485）与HRP 羊抗兔IgG（货号：ab205718）购自Abcam。

1.2 H/R 处理与分组

将PC12 细胞分为七组：control 组（正常条件21%O2/5%CO2/74%N2培养）、H/R 组（缺氧条件3%O2/5%CO2/92%N2培养2 h，正常条件下培养12 h）、H/R+异丙酚组（用50 μmol/L 异丙酚预处理1 h[6]后用H/R 处理）、H/R+anti-miR-NC 组（转染anti-miR-NC 后用H/R处理）、H/R+anti-miR-1246 组（转染anti-miR-1246后用H/R 处理）、H/R+异丙酚+miR-NC 组（转染miR-NC，再经50 μmol/L 异丙酚和H/R 处理）、H/R+异丙酚+miR-1246 组（转染miR-1246，再经50 μmol/L异丙酚和H/R 处理）。上述组别进行相关实验时，每组均设3 个复孔。转染步骤根据Lipofectamine3000 的说明书进行。

1.3 MTT 检测细胞活力

PC12 细胞用不同浓度（0、25、50、100 μmol/L）的异丙酚预处理1 h，然后用H/R 处理。取各组细胞（1×105个/ml），接种于96 孔板（100 μl/孔）培养48 h，每组6 个复孔，然后与MTT 溶液孵育4 h，与Formazan溶解液孵育4 h。在570 nm 测定吸光度值（A 值），细胞存活率为相对于对照组存活率的百分比，即细胞存活率=A实验组/A对照组×100%[10]。

1.4 Annexin V-FITC/PI 分析凋亡率

根据Annexin V-FITC/PI 试剂盒说明书，PC12 细胞用Binding Buffer 重悬，然后与Annexin V-FITC 和PI 孵育15 min。最后使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5 Western blot 分析蛋白水平

RIPA 裂解液提取总蛋白，经SDS-PAGE 电泳后，蛋白被转移至PVDF 膜上。膜经封闭后与一抗（anti-Bcl-2 稀释1∶1 000、anti-Bax 稀释1∶1 000、anti-GAPDH稀释1∶2 500）孵育，然后与HRP 羊抗兔IgG（稀释1∶50 000）孵育。最后，用ECL 溶液显示蛋白条带，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。

1.6 ELISA 分析炎症因子水平

根据ELISA 试剂盒说明书，检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 和IL-10 在PC12 细胞培养基中的水平。

1.7 定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）

总RNA 用Trizol 试剂提取，然后用逆转录试剂盒合成cDNA。用荧光定量试剂盒进行RT-PCR。引物序 列：miR-1246 正向引物：5’-TGAAGTAGGACTGGGCAGAGA-3’，反向引物：5’-TTTGGGTCAGGTGTCCACTC-3’；U6 正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO42.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O 补足体系至25 μl；反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 次循环。以U6 为内参，miR-1246 的相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，两组比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度异丙酚对H/R 处理PC12 细胞活力的影响

与control 组比较，H/R 组PC12 细胞存活率显着降低（P＜0.05）。与H/R 组比较，采用异丙酚处理后的细胞存活率上升（P＜0.05），且50 μmol/L 异丙酚处理时细胞存活率最高（图1）。故后续实验，异丙酚浓度选择50 μmol/L。

图1 不同浓度异丙酚对H/R 处理PC12 细胞活力的影响（n=6）

2.2 异丙酚对H/R 处理PC12 细胞损伤的影响

与control 组比较，H/R 组细胞凋亡率、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平升高，Bcl-2 蛋白和IL-10水平降低（P＜0.05）。与H/R 组比较，H/R+异丙酚组细胞凋亡率、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平降低，Bcl-2 蛋白和IL-10 水平升高（P＜0.05）。见图2，表1。

表1 异丙酚对H/R 处理PC12 细胞损伤的影响（，n=3）

表1 异丙酚对H/R 处理PC12 细胞损伤的影响（，n=3）

注 与control 组比较，aP＜0.05；与H/R 组比较，bP＜0.05。H/R：缺氧/复氧；Bcl-2：B 淋巴细胞瘤-2；Bax：B 淋巴细胞瘤-2 关联x 蛋白；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素

图2 异丙酚对H/R 处理PC12 细胞凋亡的影响

2.3 异丙酚对miR-1246 表达的影响

与control 组比较，H/R 组中miR-1246 表达升高（P＜0.05）。与H/R 组比较，H/R+异丙酚组中miR-1246表达降低（P＜0.05）。见图3。

图3 异丙酚对H/R 处理PC12 细胞中miR-1246 表达的影响（n=3）

2.4 miR-1246 抑制剂对细胞损伤的影响

H/R 组与H/R+anti-miR-NC 组miR-1246 水平、细胞凋亡率、Bcl-2 蛋白、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-10 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与H/R+anti-miR-NC 组比较，H/R+anti-miR-1246 组miR-1246 水平、细胞凋亡率、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β和IL-18 水平降低，Bcl-2 蛋白和IL-10 水平升高（P＜0.05）。见图4，表2。

表2 抑制miR-1246 对H/R 处理PC12 细胞损伤的影响（，n=3）

表2 抑制miR-1246 对H/R 处理PC12 细胞损伤的影响（，n=3）

注 与H/R+anti-miR-NC 组比较，aP＜0.05。H/R：缺氧/复氧；Bcl-2：B 淋巴细胞瘤-2；Bax：B 淋巴细胞瘤-2 关联x 蛋白；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素

图4 抑制miR-1246 对H/R 处理PC12 细胞凋亡的影响

2.5 过表达miR-1246 逆转异丙酚对H/R 处理PC12细胞损伤的影响

H/R+异丙酚组与H/R+异丙酚+miR-NC 组miR-1246 水平、细胞凋亡率、Bcl-2 蛋白、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-10 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与H/R+异丙酚+miR-NC 组比较，H/R+异丙酚+miR-1246 组miR-1246 表达水平、细胞凋亡率、Bax 蛋白及TNF-α、IL-1β、IL-18 水平升高，Bcl-2 蛋白和IL-10 水平降低（P＜0.05）。见图5，表3。

表3 miR-1246 过表达逆转了异丙酚对H/R 处理PC12 细胞损伤的影响（，n=9）

表3 miR-1246 过表达逆转了异丙酚对H/R 处理PC12 细胞损伤的影响（，n=9）

注 与H/R+异丙酚+miR-NC 组比较，aP＜0.05。H/R：缺氧/复氧；Bcl-2：B 淋巴细胞瘤-2；Bax：B 淋巴细胞瘤-2 关联x 蛋白；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素

图5 过表达miR-1246 逆转了异丙酚对H/R 处理PC12 细胞凋亡的影响

3 讨论

PC12 细胞具有神经细胞的一般特征，广泛应用于神经生理和神经药理学研究，且近年来多被用于在细胞水平模拟临床脑卒中过程[11-12]。在本研究，H/R 处理PC12 细胞，诱导细胞凋亡和炎症反应。另外，异丙酚通过降低miR-1246 表达抑制H/R 诱导的PC12 细胞凋亡和炎症反应，这为异丙酚治疗脑卒中提供了新的证据。

研究表明，异丙酚可减轻多种细胞损伤，具有抑制炎症反应和凋亡等作用[13]。既往的研究显示，异丙酚处理可缓解细胞炎症和凋亡[14-15]，并改善肾缺血/再灌注损伤[16]。此外，异丙酚可减轻人脐静脉内皮细胞的炎症和凋亡[17]，并缓解大鼠肠缺血/再灌注损伤[18]及减轻H/R 诱导的肝细胞损伤[19]。本研究指出，异丙酚提高了H/R 处理PC12 细胞的存活率，降低了细胞凋亡和炎症反应。这些结果显示，异丙酚可缓解H/R诱导的PC12 细胞损伤，提示异丙酚可能用于脑卒中的治疗。

miR-1246 在细胞损伤相关疾病中可发挥促进作用。在脂多糖诱导的小鼠成软骨细胞ATDC5 中，下调miR-1246 则可减轻细胞的炎症损伤[20]。沉默miR-1246 可抑制脂多糖诱导肺微血管内皮细胞凋亡和炎症因子的产生[21]。这些结果表明，miR-1246 可能具有促炎和促凋亡作用。本研究结果显示，H/R 处理PC12 细胞中miR-1246 表达升高。功能分析结果显示，抑制miR-1246 表达可以减轻H/R 诱导的PC12 细胞损伤，这与前人报道miR-1246 的功能是一致的[20-21]。

近年来，越来越多研究发现，异丙酚可通过调控相关miRNA 的表达来缓解多种细胞损伤。例如，异丙酚可通过抑制miR-449a/miR-494 表达减轻心肌细胞损伤[22-23]。异丙酚可通过调控miR-20b-5p 抑制H/R诱导的人脐静脉内皮细胞死亡[24]，并通过上调miR-153缓解缺氧诱导的PC12 细胞神经损伤[25]。本研究显示异丙酚可降低miR-1246 表达水平，且过表达miR-1246逆转了异丙酚对H/R 诱导PC12 细胞损伤的影响，这提示异丙酚通过调控miR-1246 表达减轻H/R 诱导的PC12 细胞损伤。

综上所述，本研究显示，在H/R 诱导的脑卒中细胞损伤模型中，异丙酚可通过下调miR-1246 缓解H/R 诱导的PC12 细胞凋亡和炎症。这些发现为异丙酚治疗脑卒中提供了新的证据。