丹酚酸B纯化用大孔吸附树脂的筛选

孙良明 保红云 张媛媛 万亚静 郑学双 孙百玲

（上海绿谷生命园医药有限公司 上海 201707）

丹酚酸B纯化用大孔吸附树脂的筛选

孙良明*保红云 张媛媛 万亚静 郑学双 孙百玲

（上海绿谷生命园医药有限公司 上海 201707）

目的：筛选出适合丹酚酸B纯化的大孔吸附树脂。方法：通过静态-动态吸附实验对丹酚酸B纯化用大孔吸附树脂进行筛选。以静态吸附率、解吸率，动态吸附率、洗脱率及合格洗脱率为指标考察不同型号及同一型号不同厂家的树脂纯化丹酚酸B的性能。结果：D101型大孔吸附树脂较其他型号树脂更适合丹酚酸B的纯化；而天津海光及西安蓝晓两个厂家D101型大孔吸附树脂纯化丹酚酸B的性能略有差异性。结论：D101型大孔吸附树脂适用于丹酚酸B的纯化。

丹参 丹酚酸B 大孔吸附树脂

丹酚酸B是中药丹参水溶性主要成分，具有抗脑及心肌缺血、调节血脂代谢、促血管生成及抗血小板等作用[1]，对冠心病、心绞痛[2-3]等疾病疗效显着。大孔吸附树脂因吸附量大、选择性高、易洗脱、易再生及操作简单等优点[4-5]，较常用于丹酚酸B的富集与纯化[6-8]。目前，大孔吸附树脂分离纯化丹酚酸B一般针对树脂型号、树脂用量、除杂剂、洗脱剂、流速等参数进行研究，尚未进行相同型号不同厂家树脂洗脱效果的探讨。由于目前市场上大孔吸附树脂种类众多，生产的大孔吸附树脂在树脂材料方面缺乏统一、严格的质量控制标准，导致大孔吸附树脂在性能、安全性方面存在较大差异，甚至同一型号不同厂家的树脂吸附洗脱能力也有不同，因此在研究大孔吸附树脂分离纯化丹酚酸B时，除了确定常规参数外，有必要对不同厂家同一型号树脂进行对比研究。我公司一直致力于丹酚酸B分离纯化的研究，具有较成熟的大孔吸附树脂分离纯化丹酚酸B工艺。本研究根据我公司生产需求及树脂生产现状，对不同型号及同一型号不同厂家大孔吸附树脂对丹酚酸B的吸附洗脱效果进行考察，筛选出纯化丹酚酸B效果较佳的大孔树脂，为其应用于丹酚酸B产业化生产提供依据。

1 仪器、试剂与材料

1200型高效液相色谱仪，配备四元泵及二极管阵列检测器、Chemstation数据处理软件（美国Agilent公司）；R-210型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；AB135-S型电子天平（瑞士Mettler Toledo）。

D101型大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司，天津海光化工有限公司）；HP20型大孔吸附树脂（日本三菱树脂公司）；LX101、LX17型大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司）；丹参药材（购于山东鲁安中药饮片有限公司）；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定所，95.4%，批号111562-201212）；甲醇为色谱纯；水为重蒸水；磷酸为分析纯。

2 实验方法

2.1 上柱溶液的制备

将丹参药材切粒，取丹参粗颗粒200 g，分别加入70%乙醇1 600、1 400、1 400 ml在80±3 ℃回流提取3次，每次2 h。合并提取液并减压过滤，滤液在真空度-0.06～-0.1 MPa、温度为60 ℃下浓缩至约200 ml，浓缩液加4倍量重蒸水充分搅拌，静置4 h以上，减压过滤，即得上柱溶液。

2.2 丹酚酸B的测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：甲醇-5 mmol/L磷酸二氢钾（30∶70）；进样量10 µl，流速1.0 ml/min；检测波长290 nm；柱温25 ℃；理论塔板数按丹酚酸B计算不低于1 500，丹酚酸B峰与相邻峰的分离度应大于2.0。

根据企业标准规定，在此检测条件下，丹酚酸B（色谱）纯度 ＞ 80%，峰面积 ＞ 500 mAU·s为合格洗脱液。

2.2.2 对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品15 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取2.0 ml，置20 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 样品溶液的制备

精密吸取上柱溶液或洗脱液200 µl，用流动相稀释至1.5 ml，0.22～0.45 µm微孔滤膜过滤后备用。

2.3 不同型号大孔吸附树脂的筛选

2.3.1 静态吸附法筛选大孔吸附树脂

称取HP20、LX101、D101（天津海光、西安蓝晓）、LX17型树脂适量（相当于干树脂1 g）置于100 ml锥形瓶中，精密加入上柱溶液30 ml（丹酚酸B 252 µg/ml），室温下振摇24 h（100 r/min），滤纸过滤，取滤液进行色谱检测，按照式1计算吸附率；将滤出的树脂加入到另一锥形瓶中，精密加入30%乙醇30 ml，室温下振摇24 h，取滤液进行色谱检测，按照式2计算解吸率。

注：M0、M1和M2分别为上柱液、吸附后滤液和30%乙醇洗脱液中丹酚酸B质量（µg）

2.3.2 动态吸附法筛选大孔吸附树脂

将检测合格的大孔吸附树脂160 g（约250 ml）装入层析柱（5 cm×35 cm）中，用重蒸水进行冲洗至流出液澄清。用3倍量柱体积（bed volume，BV）的95%乙醇以2.5 ml/min的流速进行洗涤，再用重蒸水冲洗至无醇味。

取上柱溶液450 ml以0.5 BV/h的流速上样，然后用3 BV的纯化水以1.5 BV/h的流速进行水洗，接着用2 BV 10%乙醇溶液以1 BV/h的流速进行洗涤除杂，流出液、水洗液和洗涤液分别取样并进行HPLC检测。

最后用4 BV 30%乙醇溶液进行洗脱，流速为1 BV/h，每10 min取样进行HPLC检测，根据式3～5计算吸附率、洗脱率及合格洗脱率，并绘制洗脱曲线。

注：C0、C1、C2和C3分别为上柱液、流出液和水洗液及10%乙醇洗涤液、洗脱液和合格洗脱液中丹酚酸B浓度（mg/ml）； V0、V1、V2和V3为上柱液、流出液和水洗液及10%乙醇洗脱液、洗脱液和合格洗脱液总体积（ml）

2.4 两厂D101大孔吸附树脂纯化丹酚酸B效果比较

称取检测合格的天津海光及西安蓝晓生产的D101型树脂160 g 各5份（柱体积250 ml），湿法装柱并进行预处理后，分别量取上柱溶液300、375、450、500 和550 ml同上吸附、洗涤和洗脱，每步取样并进行色谱检测，计算吸附率、洗脱率、合格洗脱率。

3 结果

3.1 不同型号大孔吸附树脂的筛选

3.1.1 静态吸附法筛选大孔吸附树脂

5种树脂对丹酚酸B吸附-解吸能力见图1；综合比较静态吸附率及静态解吸率，D101型大孔吸附树脂对丹酚酸B的吸附解吸效果最好，而LX17型大孔树脂作为一种极性树脂对丹酚酸B的吸附解吸能力较差，不利于丹酚酸B的纯化。

图1 5种树脂静态吸附-解吸结果

3.1.2 动态吸附法筛选大孔吸附树脂

5种树脂动态洗脱丹酚酸B的结果表明，D101型（西安、天津）大孔树脂洗脱曲线的对称性较好，峰面积较大；而LX101及LX17型树脂洗脱曲线中丹酚酸B峰面积普遍较小，曲线对称性较差，有明显的拖尾现象导致合格洗脱液增多，不利于洗脱液的收集（图2）。此外，D101型大孔吸附树脂（西安、天津）吸附率、洗脱率、合格洗脱率均较高，合格洗脱液点数较少，收集容易，且合格洗脱液质量较高；LX101型大孔树脂对丹酚酸B具有较好的吸附能力，但洗脱能力较差，导致合格洗脱液增多，合格洗脱液质量降低，合格洗脱率较低，不利于丹酚酸B的纯化（表1）。

图2 不同型号树脂洗脱曲线

表1 4种型号树脂吸附、洗脱比较

3.2 两厂D101大孔吸附树脂纯化丹酚酸B效果比较

对两个厂家D101型大孔吸附树脂进行纯化丹酚酸B效果比较，随着上样量的增大，它们的吸附率、洗脱率及合格洗脱率均呈现先上升后下降的趋势；天津海光和西安蓝晓D101型大孔吸附树脂最佳上样量、吸附率、洗脱率及合格洗脱率分别为21.25vs24.81 mg/g（丹酚酸B/大孔吸附树脂），91.83%vs92.53%、94.00%vs91.12%、87.22%vs86.01%（表2）。它们均适用于丹酚酸B的纯化，只是吸附洗脱性能略有不同。

表2 上样量对丹酚酸B纯化效果的影响

4 讨论

本论文采用静态和动态吸附-解吸法对不同型号及同一型号不同厂家的树脂进行筛选研究，除以吸附率、洗脱率等常规指标进行评价外，还在规定合格洗脱液标准的基础上，增加了以合格洗脱液及洗脱曲线作为评价指标，能更加充分地评价树脂分离纯化丹酚酸B的效果；与其他纯化方法相比，本研究能在保证较高吸附率和洗脱率的基础上得到纯度大于80%的丹酚酸B，所建立的大孔树脂质量标准及大孔吸附树脂纯化丹酚酸B的工艺对工业化生产中树脂型号、生产厂家筛选具有一定的借鉴意义。

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[3] 周保祥. 丹参多酚酸盐治疗冠心病心绞痛(心血瘀阻)临床疗效及对血液流变学影响[J]. 中国中医基础医学杂志, 2014, 20(10): 1388-1390.

[4] 屠鹏飞, 贾存勤, 张洪全. 大孔吸附树脂在中药新药研究和生产中的应用[J]. 世界科学技术, 2004, 6(3): 22-28.

[5] 王跃生, 王洋. 大孔吸附树脂研究进展[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(12): 961-965.

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Screening of macroreticular resin for the purification of salvianic acid B from Salvia miltiorrhiza

SUN Liangming*, BAO Hongyun, ZHANG Yuanyuan, WAN Yajing, ZHENG Xueshuang, SUN Bailing

(Shanghai Green-Valley Shengmingyuan Pharmaceutical Co. Ltd., Shanghai 201707, China)

Objective:To select a kind of macroreticular resin for separating salvianolic acid B from Salvia miltiorrhiza.Methods:Macroreticular resins for the purification of salvianolic acid B were screened by the static-dynamic absorption experiment. The different types of resins and the same type of resins from different companies were evaluated for their abilities to purify salvianolic acid B by measuring the rates of the static and dynamic absorption and elution and the qualified elution rate.Results:Macroreticular resin D101 was more effective for purifying salvianolic acid B than others and its absorption-elution performance to salvianolic acid B was a little bit different between the resins produced in Tianjin Haiguang and Xi’an Lanxiao.Conclusion:Macroreticular resin D101 is suitable to the purification of salvianolic acid B.

Salvia mihiorrhiza; salvianolic acid B; macroreticular resin

R284.2; TQ460.6

A

1006-1533(2015)21-0073-04

2015-07-06）

孙良明（1972-），男，高级工程师，主要从事中药工艺技术研究及质量管理。E-mail：sunliangming136@sina.com