王朝阳 吴文艺 朱世泽 杨维群 蔡玉梅 潘明孟 周仙颖 林新恭
[摘要]目的：探讨黏着斑激酶相关非激酶（facol adhesion kinase-ralated nonkinase，FRNK）在瘢痕疙瘩组织中的表达及意义。方法：利用Western-blot及反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）检测10例瘢痕疙瘩及10例相应周围正常皮肤组织中FRNK蛋白及mRNA表达水平并进行统计学分析。结果：瘢痕疙瘩组织中的FRNK蛋白表达明显低于正常皮肤（0.12±0.06比0.32±0.04），差异有统计学意义（P<0.01）；瘢痕疙瘩组织中FRNK mRNA表达明显低于正常皮肤（0.27±0.03比1.10±0.05），差异有统计学意义（P<0.01）。结论：FRNK蛋白及mRNA在瘢痕疙瘩组织中低表达，导致其对成纤维细胞凋亡作用减弱，对瘢痕疙瘩的形成可能起重要作用，通过调节FRNK的表达，有望为瘢痕的治疗提供新的靶点。
[关键词]黏着斑激酶相关非激酶（FRNK）；瘢痕疙瘩；成纤维细胞；凋亡
[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）04-0038-03
瘢痕疙瘩的病理生理特点是大量的成纤维细胞（fibroblasts，FBs）增生并伴凋亡障碍，氨基多糖和胶原在细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）中过度异常沉积，胶原纤维排列紊乱。FBs是瘢痕疙瘩形成的效应细胞，也是胶原的主要来源，多种细胞因子、信号转导通路及基因如Fas基因、转化生长因子-β（transforming growthfactor-β，TGF-β）、类胰岛素一号增长因子等通过调节FBs代谢、转化、增殖、凋亡来促进瘢痕形成。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一种位于胞浆中的非受体酪氨酸蛋白激酶，处于整合素、生长因子等多条信号转导通路之间的交汇点，在介导细胞粘附、迁移、侵袭及增殖等过程中起着重要的作用，而且FAK的主要磷酸化部位，对调节FAK的活性起关键作用。黏着斑激酶相关非激酶（facol adhesio-n kinase-ralated nonkinase，FRNK）是FAK单独表达的c末端结构域，但由于其缺乏FAK的激酶区，可以内源性的抑制FAK活性，FRNK同时可以负向调节黏着斑信号转导通路，达到抑制FAK的酪氨酸磷酸化的目的。近年来随着对瘢痕的深入研究，已经明确多种因素影响瘢痕的形成和发展，但目前尚未有明确关于FRNK与瘢痕疙瘩关系的研究。笔者采用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和Western blot，分别从mRNA和蛋白水平检测FRNK在瘢痕疙瘩中的表达，探讨其在瘢痕疙瘩形成中的作用，为瘢痕的防治提供一定的实验依据。
1材料和方法
1.1标本来源
选用2013年7月2014年10月福建医科大学附属第二医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩及周围正常皮肤，取材部位为面部、胸背部、腹部或四肢等。由于受标本例数限制，瘢痕疙瘩10例，其中，男4例，女6例，年龄2～55岁，平均（30.00±18.83）岁，病程6～24月，平均（13.70±6.31）月，病因：外伤4例，手术3例，穿耳孔1例，感染2例。各标本要求：所取标本之患者无合并皮肤疾病、结缔组织病和其它重要脏器器质性疾病，局部皮肤无溃疡及感染；所有标本患者术前均未行放化疗、激光及免疫治疗，并经过患者同意切取；所有标本均经病理证实。
1.2主要试剂和仪器
兔抗FRNK多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，DNA凝胶回收试剂盒购自TIANGEN公司，RNA提取试剂Trizol购自日本TAKARA公司，RT-PCR试剂购自德国DBI公司，DEPC及逆转录试剂盒购自美国Sigma公司，RNasin购自美国Promega公司，HRP Goat anti-Rabbit IgG购自BOSTER，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自PierceTM，Annexin V/PIapoptosis kit购自杭州联科生物公司，裂解液购自碧云天公司，ABl9700PCR扩增仪、ABl310型DNA测序仪购自美国ABI公司，Stratagene Mx3000P Real time PCR仪购自美国Agilent公司。
1.3 Western Blotting检测
应用Western blot检测10例瘢痕疙瘩及10例相应周围正常皮肤组织中FRNK蛋白的表达。每例标本取3g，将组织剪切成细小的碎片（组织直径1mm）。按照每20mg组织加入150 u l裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。12000 r/min，4℃离心5min，收集上清，用于后续实验。采用北京百泰克生物技术有限公司生产的BCA法蛋白定量试剂盒测定各样品总蛋白含量。SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加入适当稀释的一抗、二抗（一抗稀释倍数为1 000倍，二抗稀释倍数为5000倍），ECL化学发光法检测显影。底片通过凝胶灰度分析软件Quantity One
4.6.2进行灰度值定量。每组实验重复3次。
1.4 RT-PCR检测
RT PCR检测FRNK基因的表达情况：Trizol一步法提取细胞总RNA，分别抽提正常皮肤及瘢痕疙瘩组织，每组的总的RNA，调整RNA为1mg/1，以GAPDH为内参对照，进行RT PCR检测。引物合成：从Genbank中检索出基因序列，根据生物信息学的分析设计Real time PCR检测引物。FRNK引物序列为：上游引物GTTGGATCCGTCA GAACTGTGTACAATACTGGAGGAGG-3下游引物5-CTCGAATTCCAACAGACAGATGAAACCTTCCCTC-3；内参GAPDH引物序列为：上游引物5CAGCCTCAAGATCATCAGCA3，下游5TGTGGTCATGAGTCCTTCCA3。循环条件：预变性94℃5min，变性94℃ 30s，退火（P70s6k为59℃；4E-BP1为61℃）30s，延伸72℃ 1min，循环35次，终延伸72℃5min，4℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像分析系统观察，拍照并进行分析，其代表数值为平均灰度值，代表相应基因的表达量，并除以GAPDH的平均灰度值，所得数值作为各扩增产物的mRNA相对表达量。
1.5统计学处理
RT PCR实验数据采用2-ΔΔCt法进行相对表达量分析，用均数±标准差（x±s）描述，利用SPSS12.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析（One way ANOVA），P<0.05表示为差异有统计学意义。
2结果
2.1 FRNK蛋白的表达情况
Western-blot测定结果显示，瘢痕疙瘩中FRNK蛋白相对表达量为0.12±0.06，呈低表达，正常皮肤为0.32±0.04，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）（表1、图1）。
2.2 FRNK mRNA的表达情况
RT PCR检测显示瘢痕疙瘩中FRNK mRNA相对表达量为0.27±0.03，呈低表达，正常皮肤为1.10±0.05，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）（表1、图2）。
3讨论
瘢痕疙瘩由于其形成机理复杂，一直都是整形外科的难点。FRNK与肿瘤的发生、发展具有密切的关系因此，瘢痕疙瘩作为肿瘤相关性疾病，其形成发展与FRNK的关系值得深入研究。本研究应用实时荧光定量PCR和WesternBlotting实验手段，深入剖析FRNK与瘢痕疙瘩的关系。本实验的结果表明，FRNK的mRNA水平在瘢痕疙瘩中呈低表达，在正常皮肤呈高表达，这与在Western Blotting实验中所得出的结论相一致。因此，FRNK基因的异常表达可能是瘢痕疙瘩形成的一个重要原因。FAK主要分布在胞质，作为信号分子，处于细胞内多条信号转导通路的交汇点，介导细胞与ECM黏附，特别是对整合素介导的信号转导中起关键作用。整合素与ECM结合，导致FAK从细胞内移至细胞膜上，并与整合素β1相结合，发生自身磷酸化，激活下游信号分子，导致一系列生物化学效应。活化后的FAK通过多条信号转导途径调节多种细胞的增殖、迁移、分化、凋亡等多种生物学行为。Hayashida T等证实了FAK磷酸化激活ERK MAPK信号通路，导致肾系膜细胞纤维变能力增强。因此抑制FAK磷酸化能够降低细胞纤维化形成。FRNK是FAK的C-末端结构域单独表达的一种缺乏激酶区的蛋白，可作为FAK的一种内源性抑制因子，且能抑制FAK的酪氨酸磷酸化，参与FAK功能的负向调节。Oiang Ding等证实了小鼠特发性肺纤维化中FRNK表达下降，FRNK的缺损导致TGF-β信号放大，进而导致了纤维细胞迁移、肌成纤维细胞分化和信号蛋白的活化。FRNK能够抑制TGF-β介导的反应。TGF-β是多效性的细胞因子，促进肺成纤维细胞形成。有研究发现FRNK能使肝星状细胞总胶原和I型胶原合成能力降低。本实验证实了瘢痕疙瘩组织中FRNK蛋白和mRNA水平较正常皮肤少，结合瘢痕疙瘩的病理特点，笔者推测其FRNK表达减少能够导致促进成纤维细胞细胞凋亡作用减弱，瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞细胞异常增殖分化，凋亡减少，导致病理性瘢痕的形成。
本实验结果表明FRNK在瘢痕疙瘩中呈低表达，引起包括成纤维细胞在内的组织修复细胞凋亡减少，异常增殖分化，形成病理性瘢痕。故通过干预FRNK表达水平，从而促进成纤维细胞凋亡，抑制增殖，预计将是较好的预防和治疗瘢痕策略，可能具有良好的应用前景，有望为瘢痕的治疗提供新的靶点，为临床治疗瘢痕疙瘩提供新的方向。
编辑/张惠娟
