外周动脉粥样硬化中大型动物模型制备方法

张 慧，徐 放，2，崔立强，杨 丹，郑月宏

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院血管外科，北京 100730 2河北北方学院研究生院，河北张家口 075000 3中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所计算生物学与生物信息学系，北京 100094

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)相关疾病是一类严重威胁人类健康、致死致残的慢性非传染性疾病[1-2]。其基本病理变化是动脉内膜的脂质沉积，内膜灶状纤维化，粥样斑块形成，中层平滑肌钙化，致管壁变硬、管腔狭窄，引起相应器官缺血性改变，斑块破裂引起血栓栓塞等，甚至危及生命[2-4]。目前AS性疾病的保守治疗策略是通过改变患者的生活方式及药物治疗降低血脂，并根据血栓形成、出血风险等加用抗血小板治疗或联合抗凝治疗[5]；外科干预包括球囊血管成形术、支架置入术、动脉内膜切除术、旁路移植术等。但上述治疗存在不能逆转斑块进展、腔内治疗后再狭窄率高、手术创伤大等问题，因此急需发展新技术、应用新的治疗手段[6-7]。例如近年兴起的热物理治疗，是利用激光或射频消融的热效应属性，精准定位到病变部位后发出脉冲波或连续方式产生热量，汽化粥样硬化病变而达到消融目的[8]。但相应治疗可能造成血栓栓塞、内膜剥离、血管闭塞等并发症，因此在动脉疾病的腔内治疗中尚未广泛应用。上述新兴治疗手段的作用已在组织学层面、中小型动物模型中初步得到验证[8-9]，而进一步对其安全性、有效性的研究则需以合适的AS动物模型为基础[10]。本文针对AS性疾病新兴治疗的临床转化研究，就动物模型的选取和构建展开论述，从而为新兴治疗手段建立合理且与临床相似度极高的实验平台，最终目标是转化到临床治疗应用[11]。

适于临床转化的实验动物模型选取

研究AS的模型必须具备的特点是生理功能、解剖结构、体量及发病过程与人相似度高，并综合考虑易于饲养、便于管理、成本支出等问题。常用于构建AS动物模型的种类包括大鼠[3]、小鼠[12]、兔[13]、小型猪[14]、非人类灵长类等。通常以致AS性饮食诱导疾病的发生。然而，没有一个单一的动物模型是完美的[12，15-16]。

小鼠是AS模型构建的常用动物，价格低廉、易于饲养。但小鼠主要以高密度脂蛋白(high-density lipoproteins，HDL)形式转运胆固醇[17]，且缺乏胆固醇酯转移蛋白(cholesterol-ester transfer protein，CETP)，不易自发形成AS[3]。人类AS晚期斑块表面内膜被破坏，由增生的纤维帽覆盖于脂质池上，但小鼠病变不具有纤维帽，且其动脉中层的板层数目较少，未见人类大动脉中所见的特征性血管内病变[12]，故与人类心血管系统的解剖学和生理学均有明显差异[18-19]。另外，由于标本体积小或者数量少，病变主要集中在主动脉根部、主动脉弓和侧支，如无名动脉和颈动脉，而外周动脉直径与人类相差较大，不容易达到外周动脉硬化性病变实验性治疗的目的[19]。

以家兔、渡边遗传性高脂血症家兔、新西兰大白兔等为代表的中型动物模型，体型适中，便于操作，价格相对便宜[11]。兔的较大体积可以提供一些优于小鼠模型的优势，包括便于无创动脉分析，能提供足够的动脉组织和AS病变，以及为生物力学或药物设计和测试植入支架提供理想的实验平台[20-21]。但兔类同样不易自发形成AS，且其主动脉弓和降主动脉比腹主动脉的AS更重[22-23]，且很少出现包括斑块、纤维化、血栓形成在内的晚期病变[3，20，24]，故其斑块发生部位、AS形成过程和病理特点与人差异较大。

猪是较为理想的模型[24-26]，其大动脉与人的组织解剖结构相似度可达90%[27]；生化指标与人类高度相似；蛋白代谢机制与人类类似，并且可随着年龄增长自发形成AS，也可由饮食诱导以及机械手段诱发；Cullen等[28]利用猪建立腹主动脉瘤模型，出现了与人腹主动脉瘤相似的病理、生理等特征。虽然猪的AS进展较缓慢(2年左右)，但通过实验手段能够加速建立出所需的AS模型[12-13，22]。具体品类上，家猪体型大，对饲养和实验要求高，因此实验选择上逐渐向小型猪转化，例如国外的尤卡坦小型猪、汉福德小型猪、哥廷根小型猪以及国内的五指山小型猪、贵州小型猪、巴马小型猪等[29]。成年母猪体重40 kg左右，公猪体重35 kg左右[30]；贵州小型猪6月龄母猪体重为12～16 kg，公猪11～15 kg，12月龄不超过25 kg[31-32]。上述成年小型猪的体重接近成年人，是开展治疗性研究的理想载体。

非人类灵长类动物包括卷尾猴、恒河猴、食蟹猴、非洲绿猴、狒狒等[3，13]。灵长类动物与人类的生理功能及解剖结构相似度最高，具有与人类相似的脂蛋白代谢方式和HDL亚类，并且表达CETP，可以为治疗、非侵入性检查提供足够大的血管和明显的病变。但其变异性大、价格高昂，且需要非常专业的实验室科学技能[12-13]。而病变发展的可变性、高成本、可用性、可能的危险、伦理问题和处理问题是使用这些动物的主要限制[33]。

因此，小鼠、大鼠、兔等中小型动物价格相对低廉，便于饲养，许多动物通过近亲交配、同系繁殖、基因改良等手段将其生理功能达到与人类相似度极高的水平，是阐明疾病机制或基因等层面研究的理想载体。但针对热物理等临床转化治疗的研究，主要针对外周动脉硬化性疾病，同时强调与人类的相似性及治疗操作的可实施性、可转化性，通过比较几种常用动物模型发现，小型猪体型适中、价格低廉，易于实验操作，且解剖结构、生理功能、病理过程与人类相仿，有望为AS热物理治疗的临床转化研究提供一个与人类相似度较高的实验平台[25-26，34-35]。

基于高脂饮食等联合球囊损伤的AS小型猪模型构建

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)并发的AS具有斑块不稳定、供血区缺血严重及治疗后再狭窄率高等特点，成为导致T2DM患者死亡及截肢最常见病因，而诱导T2DM也成为构建AS模型的方法之一。高糖饮食诱导糖尿病模型周期较长，所以常联合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，STZ是一种含亚硝基的化合物，能选择性地破坏胰岛β细胞[22，38]。Ludvigsen等[39]用小剂量STZ诱导小型猪T2DM，轻度T2DM并不能加重AS进展；Von Wilmowsky等[40]用90 mg/kg剂量能够成功诱发家猪糖尿病，导致6个月后发生组织病理学改变。Gabel等[41]认为给予小型猪小剂量STZ，35 mg/kg不影响葡萄糖代谢；而中间剂量85 mg/kg导致短暂的糖尿病反应；100～150 mg/kg引起完全和永久的糖尿病。Hara等[42]分别用150 mg/kg、200 mg/kg STZ诱导小型猪糖尿病模型，200 mg/kg STZ组全部出现糖尿病，没有出现药物毒性引起的肾衰竭、肝衰竭等并发症。崔永春等[43]采用一次性注射150 mg STZ成功建立糖尿病模型。Wihastuti等[44]注射STZ和高脂饲料诱导的糖尿病模型，8周时总胆固醇和低密度脂蛋白水平显着升高，主动脉泡沫细胞数量及诱导型一氧化氮合成酶、细胞间黏附分子1表达均明显增加。Hamamdzic和Wilensky[14]认为高脂饮食联合STZ诱导糖尿病模型能够产生更严重的AS病变。

吸烟是动脉硬化性疾病的危险因素，烟草中的尼古丁是影响AS的主要因素，Lee和Cooke[45]进行了大量文献描述，尼古丁在体外促进内皮细胞迁移、增殖、存活和一氧化氮产生，模仿其他血管生成生长因子的作用；Fukuda[46]认为吸烟通过激活Egr-1诱导血管增生性疾病，尼古丁刺激交感神经系统并导致内皮损伤、降低HDL水平；Wang等[47]认为尼古丁能够增加动脉硬化斑块的尺寸和动脉壁的损伤；王茜倩等[48]利用尼古丁25 mg/kg灌胃小鼠，每天2次并结合维生素D3灌胃能成功加速动脉的钙化；Li等[49]将尼古丁以100 mg/L的剂量注入到饮水中加速AS构建；祎史等[50]用25 mg/kg尼古丁灌胃和维生素D3肌注诱导大鼠血管钙化。

常见的血管损伤术包括球囊损伤、血流动力学改变法、免疫法等，每种方法各有其缺点。血流动力学改变法通过颈动脉部分结扎，动脉狭窄时血流出现黏性摩擦应力建立AS模型，颈动脉部分结扎法较常用，手术方法简单，便于操作，但是术后易感染导致动物死亡，并且对动物创伤较大[51-52]；免疫法用牛血清白蛋白、卵清白蛋白、内毒素等进行免疫刺激，从AS机制和病因角度诱发AS的形成，该方法思路较新颖，可以通过检测血清相应免疫分子，为研究疫苗预防AS提供线索，为疾病的临床分析和治疗提供可靠依据[53]；球囊损伤法是运用球囊扩张和拖拉造成动脉内皮细胞损伤和脱落，使血小板、脂质更易沉积在血管壁上，并且晚期斑块特征与人相似，目前球囊损伤技术被证明可通过机械损伤造成任何物种的动脉内膜增厚，也可以缩短模型构建周期[37，54]。根据所需部位的动脉，选取球囊内径与血管内径之比1.3～1.4∶1为宜[55-56]，球囊的选取合适与否可能会加速或延缓AS的进程[24]。刘加春等[55]根据颈动脉直径，选取7 mm球囊，术后病理证实内膜连续性被成功破坏。球囊损伤法形成的斑块位置确切，操作可控性强，便于研究者实施各种干预措施后观察AS的变化。构建后取所需球囊损伤部位的动脉进行病理学检查，观察动脉内壁的变化情况、狭窄程度、是否达到晚期病变等。刘加春等[55]用高脂联合球囊损伤组6例中5例出现较为典型的纤维帽结构和明显的泡沫细胞与脂质沉积。余飞等[57]用油红O染色发现在斑块的中央可见大片的红色脂滴池存在，表面有纤维组织覆盖，形成典型的“纤维帽”。

因此，短时间内建立AS模型需要在高脂、高胆固醇饮食的基础上借助一些特殊手段，包括球囊损伤术、血流动力学改变法、免疫法等[53]。其中，球囊损伤能更精准地在短周期内建立外周AS模型，并且更易出现所需的晚期病变。常用的方法是选取6-7 Forgaty导管穿刺入目标股动脉，在数字减影血管造影检测下，逆行插入球囊，连接手推式压力泵，注入生理盐水，膨至2个大气压，自远心端缓慢回拉，反复抽拉3次后撤出导管。建立模型成功后需要定期复查血管造影、外周血管超声等明确外周AS性病变狭窄程度及斑块性质，进一步行治疗性实验研究。

综上，小型猪是研究人类AS和脂蛋白代谢的重要模型，在高脂饲养的基础上结合球囊损伤术构建的小型猪AS模型，为阐明AS病理机制提供了有力条件，也为展开新的治疗手段的临床前实验研究提供了理想平台。期待小型猪为AS性疾病的新兴治疗手段提供更多、更全面的新见解，为临床转化奠定坚实的基础。