(1 菏泽市立医院检验科，山东 菏泽 274000； 2 青岛大学附属医院检验科； 3 青岛市妇女儿童医院教育科； 4 青岛大学附属医院产前诊断中心)
抽动秽语综合征(TS)是一种主要于儿童时期起病的神经精神系统疾病，主要表现为多种运动性抽动合并一种或多种发声抽动，同时伴有强迫障碍和注意力缺陷多动障碍[1]。遗传因素是导致这一复杂的神经精神性疾病的主要原因[2]，目前TS的发病率已经超过1%[3-4]。近年来，新发现的SLITRK基因家族逐渐受到研究者关注，其所编码的蛋白质具有调节神经突触生长的作用[5]。SLITRK基因家族共发现有6名成员，分别命名为SLITRK1～6[6]。ABELSON等[7]在2005年研究发现TS病人染色体的13q31.1处的SLITRK1基因中有2处罕见突变var CDf和var321，可能与TS的发生有一定的关系，SLITRK基因家族可能通过其所编码的蛋白质来调控神经突触的生长，基因突变会使其所编码蛋白抑制突触生长。KANG等[8]证实，SLITRK1与SLITRK4基因突变会影响神经元树突的正常生长，使突触密度显着降低。研究证实，SLITRK3分子可显着抑制神经突触轴突生长[9]，SLITRK6基因突变可以导致哺乳动物神经突触密度降低[10-11]。本次试验选取295例TS核心家庭成员(包括病人及其生物学父母)作为研究对象，旨在探讨SLITRK6基因rs3825413和rs7336083位点的单核苷酸多态性与中国汉族人群TS发病的关联性。
1 对象和方法
1.1 研究对象
选取2007—2018年于青岛大学附属医院、东营胜利油田中心医院、青岛市妇女儿童医院、日照人民医院和临沂市人民医院就诊的TS病人295例，男221例，女74例；平均年龄(8.26±2.84)岁。所有病人均经由临床工作经验丰富的神经与精神病学专家确诊，且临床表现均符合《美国精神疾病诊断与统计手册》第4版(DSM-Ⅳ)或第5版(DSM-Ⅴ)中关于TS的诊断与排除标准。本项研究已通过青岛大学附属医院伦理委员会的审核并批准，所有研究对象在血液标本采集前均已由本人或其法定监护人签署了知情同意书。鉴于TS发病具有明显的遗传倾向，因此，本次研究也同时将病人的生物学父母纳入研究范围，以此来探讨其发病的遗传学特征。
1.2 仪器和试剂
TaqMan荧光探针以及Taq酶体系由美国的Invitrogen有限公司提供，普通PCR引物以及普通PCR底物的混合液由青岛擎科梓熙生物技术有限公司提供，天根全血基因组DNA提取试剂盒由青岛秀佰锐生物器材有限公司提供，普通PCR仪由美国PE公司提供，C1000TM Thermal Cycler荧光定量PCR仪由美国Bio-rad(伯乐)公司提供，电泳仪由上海复星高科技集团公司提供，凝胶成像仪由美国宝丽来公司提供。
1.3 实验方法
1.3.1研究对象DNA的提取 采用静脉采血器采集研究对象(病人及其生物学父母)的肘静脉血共2 mL，置于含有EDTA抗凝剂的真空采血管中，震荡摇匀后置于-20 ℃冰箱中，吸取其中的200 μL用全血基因组DNA提取试剂盒提取患者及其父母的DNA，使用酶标仪检测提取DNA的纯度和浓度，合格的标本置于-20 ℃冰箱备用。
1.3.2实时荧光定量PCR 采用Taqman探针以实时荧光定量PCR技术检测SLITRK6基因2个SNP位点(rs3825413和rs7336083)的基因型。所用探针及引物均由美国Applied Biosystems of Life Technologies(ABI)生物技术公司设计并研制。其中rs3825413位点的上游引物序列为5′-TATCCTCAAGGTCAATCTGGGTTAG-3′，下游引物序列为5′-AAATCAAGATCATCCAAAATATTAC-3′；rs7336083上游引物序列为：5′-TGTGGCATGATT-TTGGCCCTTGACA-3′，下游引物序列为5′-AGG-TGACTACCAGACAAAAACTAGA-3′。RT-PCR总的反应体系为25 μL，其中含12.5 μL的2×TaqMan Genotyping Master Mix，1.25 μL的20×TaqMan探针原液，1 μL的待测样本DNA模板以及10.25 μL的去离子水；RT-PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，退火延伸1 min(温度56～60 ℃)，循环45次。C1000TM Thermal Cycler的每次循环均检测不同等位基因发出的不同的荧光强度，用VIC或FAM表示,以此判断各待测样本的基因分型情况。
1.4 统计学分析
采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学处理。对TS患者及其父母的SLITRK6基因rs3825413以及rs7336083位点基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验。采用传递不平衡检验(TDT)和单倍型相对风险分析(HRR)检测有无传递不平衡现象以及两组间的差异有无统计学意义，同时采用基于单倍型的HRR(HHRR)对上述结果进行验证。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 Hardy-Weinberg平衡检验
Hardy-Weinberg平衡检验结果表明，本研究的所有研究对象的遗传分布均达到了平衡，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 研究人群的TDT、HRR和HHRR
对295例TS病人及其生物学父母的SLITRK6基因rs3825413、rs7336083位点的多态性分别进行TDT、HRR和HHRR，结果显示，两个位点的多态性与TS发病之间均不存在明显关联(rs3825413位点TDT:AA为279例，AG为142例，GA为121例，GG为48例，χ2=1.677,P=0.217,OR=0.779，95%CI=0.527～1.152；HRR:χ2=0.821,P=0.365,OR=0.863,95%CI=0.623～1.190；HHRR:χ2=1.766,P=0.184,OR=1.183,95%CI=0.923～1.517。rs7336083位点TDT:AA为127例，AG为157例，GA为136例，GG为170例，χ2=1.505,P=0.243,OR=1.011，95%CI=0.731～1.399；HRR:χ2=1.793,P=0.181,OR=1.271，95%CI=0.895～1.805；HHRR:χ2=1.503,P=0.220,OR=1.154,95%CI=0.918～1.451)。结果见表1、2。
3 讨 论
TS一般发病于儿童时期，超过90%的病人通常在10岁之前发病，男女患病率约为4∶1[12]。大多数TS病人通常会合并其他精神性疾病，其中最常见是强迫症和注意力缺陷多动障碍，伴发的共病发病率以及严重程度在不同的研究人群中各不相同[13]。目前临床上用于缓解TS症状最广泛的药物是氟哌啶醇、阿立哌唑等神经精神镇静类药物，这些药物有效成分大多含有多巴胺受体激动剂，改善抽动症状的疗效已经得到临床广泛认可[14]。TS病人神经系统药物治疗的有效性进一步提示，TS与中枢神经系统基底节-丘脑-皮质环路的病变密不可分，KALANITHI等[15]在对TS死亡病人进行尸检研究时发现，TS病人基底节中间神经元的跨膜蛋白较正常人显着减少；另外TS病人大脑MRI的扩散张量成像(DTI)结果显示，病儿左侧苍白球和双侧丘脑的信号明显下降，尾状核、壳核的表观弥散系数(ADC)值明显增加，表明这些病儿的大脑结构存在异常[16]。
表1SLITRK6rs3825413(A>G)和rs7336083(G>A)位点的HRR分析结果
分组rs3825413(A>G)G(+)G(-)rs7336083(G>A)A(+) A(-)传递组14614921283未传递组15713819798
表2SLITRK6rs3825413(A>G)和rs7336083(G>A)位点的HHRR分析结果
分组rs3825413(A>G)AGrs7336083(G>A)A G传递组421169284306未传递组400190263327
SLITRK家族蛋白富含亮氨酸串联重复序列，在哺乳动物神经系统中高度表达，通过与白细胞共同抗原受体酪氨酸磷酸酶相互作用，共同调控突触的发生及其功能[17]。SLITRK基因调节神经突触生长的方式各不相同，其中，SLITRK2主要在不成熟神经元中表达，起到抑制神经元突起生长的作用，而主要在成熟神经元中表达的SLITRK1，能够诱导神经元突起生长发育[18]。正如其他突触黏附分子一样，SLITRK基因的某些点突变已被证实与精神分裂症、强迫症、TS和注意力缺陷多动障碍等疾病的发病存在关联。研究显示，SLITRK6基因与TS的致病相关，SLITRK1、SLITRK2、SLITRK4基因的一些错义突变与精神分裂症、强迫症病人的发病密切相关[19]。
为进一步探讨SLITRK6基因与TS之间的关系，本研究通过分析rs3825413、rs7336083位点多态性来探讨SLITRK6基因与山东汉族人群TS病人发病之间的关联性。结果表明，山东地区汉族人群SLITRK6基因与TS之间不存在明显的关联，即SLITRK6基因可能不是TS的易感基因。但是基因多态性受种族及地域分布影响较大，本文的研究对象及选择标准仅针对中国山东地区的汉族人群，局限性较大，所以两者之间的关联性仍需进一步在不同地域以及种族中查验。同时，本研究样本仅为295例TS核心家系成员，样本量较小，今后的关联研究仍需扩大样本量继续分析。
