陈晨 田甜 于啸 孙文瑜 娄艳辉

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266100 1 妇科； 2 护理院感部)

高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ova-rian cancer, HGSOC)是上皮性卵巢癌最常见的病理类型，肿瘤具有较高的恶性生物学行为，极易发生广泛的盆腹腔内转移，严重威胁卵巢癌患者的生命安全。因此，探讨HGSOC侵袭转移的可能分子机制具有重要意义[1]。微小核糖核酸(miRNA)作为调节性短非编码核糖核酸，通过调节多种信号通路进而参与肿瘤的发生与发展[2]。miR-181a-5p是miR-181家族的重要成员之一，研究表明miR-181a在肝癌及乳腺癌等多种实体肿瘤及血液肿瘤中异常表达，参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移等多种生物学特性，并且在Wnt/β-连环蛋白和TGF-β信号通路当中起着关键的调节作用[2-3]。然而，有关miR-181a-5p在HGSOC中的表达特点及功能尚不十分明确。中胚层特异性转录基因(MEST)是一种父源性印记基因，位于染色体7q32，在胎儿组织中表现出来自父系等位基因的优先表达，MEST启动子的异常甲基化与肿瘤的侵袭转移密切相关[4-5]。生物学信息分析发现miR-181a-5p与MEST之间存在靶向结合位点，因此推测二者之间可能存在一定的功能调控关系。本研究通过检测miR-181a-5p与MEST在卵巢癌组织中的表达，旨在初步探讨二者的表达特征及其与患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床研究

1.1.1一般资料 选取2019年7月—2021年11月我院因HGSOC行手术治疗的卵巢癌患者56例。所有患者术前均未经过放疗及化学治疗，患者的最终诊断均经病理检查证实。术前签署患者知情同意书，留取患者术中新鲜的卵巢癌组织作为研究样本。收集同期因子宫肌瘤行子宫+双附件手术切除的56例患者的正常的卵巢及输卵管伞端组织作为对照。分别取卵巢癌患者的卵巢癌组织及对照组正常卵巢组织、正常输卵管伞端组织各约1 cm×1 cm×1 cm大小，在离体30 min内置于装有RNA保存液的冻存管中转入-80 ℃冰箱内保存备用。

1.1.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测卵巢癌组织、正常卵巢组织及正常输卵管伞端组织中miR-181a-5p和MEST的表达 各取卵巢癌组织、正常卵巢组织及正常输卵管伞端组织100 mg于匀浆器中，利用研磨器研磨成粉末状，加入1 mL Trizol试剂处理，转移匀浆至无RNAase的EP管中，在4 ℃下离心20 min后取上清液，之后步骤均严格按照Trizol试剂说明书进行操作。使用紫外分光光度计测定260、280 nm波长处的RNA样本浓度以及吸光度(A)值，当1.8

表1 引物名称及其序列

1.1.3一般资料的收集 收集卵巢癌患者的一般资料，包括年龄、体质量、术前血清中CA125水平、肿瘤临床分期及是否有淋巴结转移等。

1.2 基础研究

1.2.1细胞培养 将卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞SKOV3(购自美国典型微生物菌种保藏中心)接种于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱培养，每隔1～2 d换液一次，当细胞的密度达到约80%且生长良好时，用胰蛋白酶消化后每瓶细胞以1∶3的比例进行细胞传代，或直接加入细胞冻存液置于-80 ℃冰箱冻存，用于后续双荧光素酶实验。

1.2.2双荧光素酶报告基因验证miR-181a-5p与MEST的靶向关系 ①采用TargetScan(www.targetscan.org)和miRanda(www.microrna.org)生物信息学软件预测miR-181a-5p与MEST是否存在靶向结合位点。②利用双荧光素酶试剂盒(购自大连美伦生物科技有限公司)进行验证：采用PCR技术将含miR-181a-5p结合位点的MEST核苷酸序列片段插入野生型(WT)荧光素酶报告基因载体中，构建MEST-WT质粒；同时，应用基因突变技术将结合位点突变后，插入突变型(MUT)荧光素酶报告基因载体中，构建MEST-MUT质粒。将miR-181a-5p分子模拟物(mimics)以及其阴性对照序列(NC mimics)分别与MEST-WT、MEST-MUT质粒同时转染SKOV3细胞，分为4组：MEST-WT+NC mimics、MEST-WT+miR-181a-5p mimics、MEST-MUT+NC mimics及MEST-MUT+miR-181a-5p mimics组；在转染前24 h，首先取对数生长期的SKOV3细胞在24孔板铺板(确保转染时的细胞密度在50%～70%)；按照脂质体2000(美国Invitrogen 公司)说明书要求向1.5 mL EP管中先后加入10 μL无血清培养基、适量待转染的试剂以及脂质体2000转染试剂，静置10 min，形成转染复合物；将转染复合物加入24孔板中，充分混匀，培养6～8 h后换成有血清的培养基，置于培养箱中继续培养24 h后，参照双荧光素酶报告基因实验检测试剂盒的说明书检测荧光素酶活性，荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。实验重复3次,实验结果取均值。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 3种组织miR-181a-5p及MEST表达量比较

测定miR-181a-5p在卵巢癌、输卵管伞端及正常卵巢组织中的相对表达量分别为0.383±0.165、0.987±0.036和0.996±0.050，MEST在卵巢癌、输卵管伞端以及正常卵巢组织中的相对表达量分别为4.016±0.182、0.993±0.045和1.004±0.048，3种组织中miR-181a-5p和MEST相对表达量比较差异均有显着性(F=123.236、234.764，P<0.05)。Pearson相关性分析结果则显示，miR-181a-5p与MEST的相对表达量呈显着负相关(r=-0.985，P<0.01)。

2.2 卵巢癌组织中miR-181a-5p及MEST表达与临床病理特征间的关系

卵巢癌组织中miR-181a-5p及MEST的表达与患者年龄及体质量无关(P>0.05)；miR-18a-5p及MEST的表达与肿瘤FIGO分期有关，其中Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者miR-181a-5p的表达高于Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者MEST的表达低于Ⅲ～Ⅳ期(χ2=15.002、33.547,P<0.05)；miR-181a-5p及MEST表达与患者有无淋巴结转移有关(χ2=7.844、11.187,P<0.05)；miR-181a-5p以及MEST表达与患者血清中CA125的表达水平有关(χ2=19.575、4.548，P<0.05)。见表2。

表2 卵巢癌组织中miR-181a-5p、MEST的表达及与临床病理特征的关系(例)

2.3 双荧光素酶实验验证miR-181a-5p与MEST靶向结合位点

通过生物信息学分析预测到miR-181a-5p与MEST存在靶向结合位点，见图1。miR-181a-5pmimics+MEST-WT组SKOV3细胞的荧光素酶的活性为0.41±0.23，NC mimics+MEST-WT组为0.98±0.04，两组比较差异有显着性(t=8.726,P<0.05)；miR-181a-5p mimics+MEST-MUT组SKOV3细胞的荧光素酶活性为0.97±0.01，NC mi-mics+MEST-MUT组为0.98±0.04，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-181a-5p 能抑制MEST-WT的荧光素酶活性，而对MEST-MUT无影响，验证了miR-181a-5p与MEST存在靶向结合位点。

图1 miR-181a-5p与MEST的核苷酸序列结合位点

3 讨 论

HGSOC是上皮性卵巢癌中最常见的一种病理类型，因其恶性程度高、侵袭性强，早期无明显临床症状及体征，70%～80%的患者诊断时已为晚期，居女性生殖系统疾病患者病死率的首位。广泛盆腹腔转移是HGSOC临床进展的主要特征，也是最终导致病人死亡的主要原因，然而有关其侵袭转移的分子机制仍不十分明确。由于其具有极易发生转移、耐药和复发的特性，在治疗上依然面临着极大的难题[6-7]。因此，探讨卵巢癌复发和转移的可能分子机制，寻找其治疗靶点显得尤为重要。

miRNA作为调节性短非编码核糖核酸，通过调节多种信号通路参与肿瘤的发生与发展。miR-181家族现有8个成熟序列[8]。近年来的研究结果显示，miR-181a-5p在多种实体肿瘤组织如宫颈癌[9]、直肠癌[10]、肝癌[11]等组织中异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关。miR-181家族受Wnt/β-catenin信号通路以及竞争性内源性RNA等多种机制的调节，从而参与肿瘤的发生发展过程[2,12]。研究显示，miR-181a-5p在宫颈癌组织中受CCAT1的调控而表达下调，进而上调MMP14表达而促进宫颈癌细胞增殖和侵袭[9]。在直肠癌中，miR-181a-5p的表达受到癌基因CRNDE的抑制，进而激活Wnt通路，促进直肠癌的发生、发展和转移[10]。然而，有关miR-181a-5p在卵巢癌中的表达尚存在不一致的报道[13-14]，其在卵巢癌中的表达和功能调控可能存在较为复杂的分子机制。本研究结果显示，miR-181a-5p在卵巢癌组织中低表达，Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者miR-181a-5p的表达高于Ⅲ～Ⅳ期,而且与淋巴结转移密切相关，提示miR-181a-5p在卵巢癌发生发展中可能发挥抑癌基因的作用，但相关分子调控机制目前尚不明确。

MEST是一种父源性印记基因，主要通过组织特异性及启动子甲基化调控的印记丢失参与肿瘤的发生与发展[4]。有研究表明，MEST在乳腺癌组织中表达上调，并且能够促进乳腺癌细胞的增殖过程。敲除乳腺癌细胞内MEST的表达可以降低肿瘤细胞的增殖活性，促进细胞凋亡，MEST的过度表达可以降低ZFP57对Wnt/β-catenin途径的抑制作用[15-17]。然而，有关MEST在卵巢癌表达及临床意义尚少见报道。本研究通过检测HGSOC组织中MEST表达，发现MEST表达水平明显增高并与miR-181a-5p表达呈显着负相关，且Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者MEST的表达低于Ⅲ～Ⅳ期患者。结果表明，卵巢癌组织中miR-181a-5p与MEST间似乎存在某种调控关系。本研究再通过生物学分析预测并验证了miR-181a-5p与MEST之间存在有意义的靶向结合位点，低表达的miR-181a-5p可能失去了对MEST表达的调控作用，进而促进肿瘤的恶性生物学行为。有研究显示，miR-181a-5p作为抑癌基因可抑制Wnt信号通路的活性，通过调控上皮间质转化过程进而抑制癌细胞的迁移和侵袭[18-19]，而MEST的高甲基化通过维持β-catenin蛋白稳定表达促进肿瘤发生，也与Wnt/β-catenin信号通路的激活密切相关[5]。另有研究显示，骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞释放的同家族成员miR-181c可以下调MEST表达，使Wnt/β-catenin信号通路失活，从而抑制卵巢癌细胞对顺铂的耐药性[20]。结合本研究结果，可以推测miR-181a-5p与MEST间的互作调控可能与Wnt/β-catenin信号通路的活性密切相关，在卵巢癌的发生发展中可能发挥重要作用。

本研究还显示，miR-181a-5p及MEST的表达水平均与血清中CA125的表达相关，从而为进一步探讨两者联合血清中CA125检测在卵巢癌诊断、治疗以及随访中的作用奠定了基础。

总之，本研究结果显示，miR-181a-5p在高级别浆液性卵巢癌中表达下调，可能通过调控MEST表达在肿瘤进展及转移中发挥抑癌基因的功能。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL26953)。所有试验过程均遵照《人体医学研究的伦理准则》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

EthicsApprovalandPatientConsent：All experiments involved in this study have been reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University(Document No.QYFYWZLL26953).All experiments were conducted in accor-dance with The Regulations of The Code of Ethics for Human Medical Research.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献：陈晨、田甜、孙文瑜参与了研究设计；陈晨、于啸、娄艳辉参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions：The study was designed byCHENChen,TIANTian, andSUNWenyu.The manuscript was drafted and revised byCHENChen,YUXiao, andLOUYanhui.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.