方爱仙 杨建兰

老年心脑血管疾病亚甲基四氢叶酸还原酶基因型与叶酸代谢相关指标的关系

方爱仙 杨建兰

目的 探讨老年心脑血管疾病亚甲基四氢叶酸还原酶基因型与叶酸代谢相关血液指标的相互关系。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP） 法检测286例老年心脑血管疾病患者 MTHFR 基因中C677 T基因型。全自动生化分析仪测定VB12、叶酸、HCY及其他部分生化指标的血清浓度，血细胞分析仪测定血常规部分指标。结果 老年心脑血管疾病患者中MTHFR 基因C677T 位点基因型CC型82例占28.7%，CT型118例占41.3%，TT型86例占20%；MTHFR 基因C677T 位点基因型TT 携带者血浆Hcy 水平显着高于基因型CC及CT 携带者（P＜0.05），叶酸、VB12血清水平以TT最低（P＜0.05）。TT、CT、CC组的β-羟丁氨酸、肌酐、尿素氮、脂蛋白A值依次升高（P＜0.05）。结论 老年心脑血管疾病MTHFR基因型以CT型和TT型为主。TT型患者HCY水平最高，而叶酸和VB12水平最低。TT型可能是最易引起老年心脑血管疾病的危险因素。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因 心脑血管疾病 生化指标 叶酸 HCY

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是催化同型半胱氨酸（HCY） 转化成蛋氨酸的关键酶，高HCY血症与心脑血管梗死的关系日益受到人们关注。MTHFR 基因缺陷是致动脉性疾病和静脉栓塞的危险因素［1］。TT外显子677位点上存在等位基因C和T多态现象。通常等位基因C为野生型，T为突变型。C与T对应氨基酸残基分别为丙氨酸和缬氨酸。缬氨酸取代丙氨酸后使MTHFR稳定性和活性下降，引起机体Hcy蓄积，导致高Hcy血症，从而促进动脉粥样硬化的形成［2］。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2013年10月至2014年9月本院住院的286例老年心脑血管疾病患者（其中脑动脉粥样硬化18例，脑动脉供血不足15例，冠状动脉粥样硬化型心脏病42例，冠心病心律失常14例，高血压病207例）。其中男167例，女119例；年龄78～91岁，平均85.3岁。

1.2 试剂 Tris-HCl 饱和酚购于北京邦定公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP mix 为Gibco BRL 公司产品；Hinf Ñ、Hae Ó限制性内切酶及DNA分子量标准PUC19DNA/ MSPÑ为MBI公司产品；丙烯酰胺购自Promega公司；甲叉双丙烯酰胺、TEMED购于上海生物工程公司；PCR引物由上海生物工程公司合成；Big-Dye 测序试剂盒为Perkin Elmer 公司产品。同型半胱氨酸检测试剂盒（酶比色法）购自重庆中元生物技术有限公司。叶酸检测试剂盒（电化学发光法）购自罗氏诊断试剂公司。维生素B12（VB12）检测试剂盒（增强化学发光免疫分析法）购自北京泰格科信生物科技有限公司。

1.3 操作方法 （1）清晨空腹取静脉血8ml，2%EDTA抗凝，1h内将标本离心（4e，3000r/min，5min），取血浆置- 20℃保存备检。（2） 盐酸胍法提取DNA，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法检测MTHFR 基因C677T基因型。C677T引物S 5c-TGAAGGA GAAGGTGTCTGCGGA-3c 和AS5c-AGGACGGT GCGGTGAAGTG-3c。（3） 50μl PCR反应体系含引物S 和AS 各200nmol/L、200nmol/L dNTPs 5μl、10× Buf fer 5μl、DNA 模板3μl、10%二甲基亚砜5μl、Taq DNA聚合酶2U，加双蒸水至50μl，混匀加石蜡油封闭。（4） PCR 反应程序为94℃预变性5min，随后按94℃ 55s、55℃ 55s、72℃ 60s 进行热循环35次，最后72℃延伸7min。2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。（5） 取扩增产物25μl，加Hinf I内切酶10U混匀，37℃过夜，消化产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴乙啶染色后分析MTHFR基因型。（6）统计处理频率分布。（7） HCY采用OLYMPUS AU5400生化仪测定。（8）叶酸和VB12采用美国雅培i2000化学发光免疫分析仪测定。（9）采用OLYMPUS AU5400生化仪测定部分生化指标。（10）采用sysmex血常规分析仪测定红细胞和血小板的部分参数。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR基因型分布和叶酸、VB12、HCY结果比较 286例患者中CC型82例占28.7%，CT型118例占41.3%，TT型86例占20%。等位基因C占49.3%，T基因占50.7%。TT型HCY水平明显高于CC和CT组（P＜0.01），VB12和叶酸明显低于CC和CT组（P＜0.05）。说明基因型TT是血浆HCY水平升高的危险因素。

2.2 不同MTHFR基因型部分生化指标结果比较 MTHFR的CC、CT、TT三型的空腹血糖、β-羟丁氨酸、肌酐、甘油三酯、低密度脂蛋白、平均红细胞体积（MCV）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、平均血红蛋白含量（MCH）、血小板总数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、大血小板比例均有统计学意义（P＜0.05），TT组的空腹血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白水平、大血小板比例明显高于CC和CT组（P＜0.05），说明TT基因型是糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、血栓发生的高危因素。

3 讨论

HCY 是蛋氨酸转甲基后生成的中间代谢产物，HCY 在叶酸、维生素B12参与下，经MTHFR及蛋氨酸合成酶催化接受甲基重新合成蛋氨酸。如果叶酸、维生素B12缺乏，HCY 代谢相关酶MTHFR、胱硫醚B合成酶基因突变使酶缺乏和活性降低，均可使HCY再甲基化障碍，引起血浆HCY水平升高。HCY可引起血管内皮细胞损伤，促进血栓形成，高HCY 血症是心脑血管疾病的独立危险因素［3］。其机制可能与其对血管内皮细胞的毒性作用以及增加血液中血小板的粘附性均有关［4～6］。

MTHFR基因第4外显子的一个较为常见的错义突变C677T，通过聚合酶链式反应（PCR）可以获得该基因677位点的基因片段，全长198bp，如果存在突变，则可产生Hinf I限制酶酶切位点，经Hinf I内切酶作用后可切出175bp和23bp两个片段。突变后产生3三种基因型： 野生纯合型C /C（198bp）、杂合型C/T（198/175bp） 及突变纯合型T /T （175bp）［3］。C677T碱基突变可使MTHFR的热敏感性改变而致酶活性改变。TT基因型的MTHFR 酶活性最低，CT型的酶活性中等，CC型的酶活性最高，酶活性的下降可使Hcy 的水平不同程度的升高。本资料进一步证实了基因型TT携带者血浆HCY水平最高，CT次之，CC最低，基因型TT和CT及CC型血浆HCY比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。CC、CT、TT组血清叶酸水平依次降低，以TT组最低，CC组最高，说明CC组MTHFR的酶活性最高。除此之外，MTHFR的基因多态性对空腹血糖、β羟丁氨酸、肌酐、甘油三酯、低密度脂蛋白、脂蛋白A等生化指标和MCV、MCHC、MCH等血常规指标以及PLT、MPV、大血小板比例等血小板部分参数亦存在一定影响，CC、CT、TT三组之间亦有明显差异。CT组的PLT数量明显大于CC和TT组的（P＜0.05）。CC组的MPV大于CT和TT组（P＜0.01）。TT组大血小板比例大于CC和CT组（P＜0.01）。说明TT基因型是引起血栓的危险因素。TT组的空腹血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白水平、大血小板比例明显高于CC和CT组（P＜0.05），说明TT基因型与糖尿病，高血脂，动脉粥样硬化，血栓发生存在一定的相关性。

1 Sahu JK,Sriwastva M,Prakash K． An association between methylenetetrahydrofolate reductase (C677T) polymorphism and largeartery ischemic stroke． Acta Neurol Scand,2012,125(1):26～30．

2 Malinowska A,Chmurzynska A． Polymorphism of genes encoding homocysteine metabolism -related enzymes and risk for cardiovascular disease． Nutr Res,2009,29(10):685～695．

3 宋宁,徐秀英．MTHFR基因的多态性及高同型半胱氨酸血症与心脑血管疾病发生的关系．心脏杂志, 2005,26(1):41～43．

4 Bailey LB, Gregory JF． Polymorphisms of methylenetetr ahydrofolate reductase and other enzymes: metabolic significance, risks and impact on folate requirement．J Nutr,1999,129(5):919～922．

5 张铭,陈怀生,杨大春,等．同型半胱氨酸对血管内皮细胞的氧化应激损伤及对IL-8 分泌的影响．心脏杂志,2005,17(5):450～452．

6 蒋晖,李锦,毛建斌,等．同型半胱氨酸对细胞内皮CD40表达的影响．心脏杂志,2004,16(5):431～434．

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