万凤 杨汝春⋆ 时延朋 张华琴
肾小管间质纤维化（TIF）是各种慢性肾脏病（CKD）进展至终末期肾病（ESRD）的共同通路和主要病理特征［1］。研究发现，肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）是TIF发生发展的核心环节［2］。EMT受多种生长因子和细胞因子的调节，其中最重要的是转化生长因子β1（TGF-β1）。实验表明TGF-β1参与多数肾脏病中进展性肾纤维化的病理形成［3］。目前，有关桑黄提取物在肾小管上皮细胞EMT发生中的作用研究尚未见报道。因此，本文以大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞为研究对象，观察桑黄PA、PW和PP对TGF-β1诱导的NRK-52E细胞EMT的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）细胞株：大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E，购于中国科学院细胞库，细胞系目录号GNR 8。（2）药物与试剂：PA、PW和PP均由浙江省农业科学院提供。胎牛血清（Gibco），DMEM低糖培养基，0.25%胰酶-EDTA，双抗、CCK-8试剂盒均购自杭州达文生物有限公司；RT-PCR引物由上海生工生物有限公司合成。TGF-β1（R＆D公司），TRIzol reagent（Invitrogen），逆转录试剂盒和SYBR® Premix Ex TaqTM均自TaKaRa公司。
1.2 细胞培养 采用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的DMEM低糖培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中常规培养，进行换液1次/1～2d。当细胞生长融合至80%～90%融合时，用含0.25%胰酶-EDTA溶液进行消化细胞，吹打均匀并传代。
1.3 CCK-8法测定NRK-52E细胞存活率 消化收集对数增殖期NRK-52E细胞并以1×108/L的密度接种于96孔板，每孔100μl，细胞贴壁后用无血清培养基同步化24h。之后实验组分别加入不同浓度的采用含2%FBS DMEM培养基配制的倍比稀释的PA、PW和PP，每孔100μl，终浓度分别为1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和 400μg/ml，对照组加入等体积2% DMEM培养基，每组设置6个复孔。培养48h后每孔加入10μl CCK-8 溶液，37℃反应2h后于450nm波长处检测每孔吸光度值。细胞生存率及增殖抑制率按如下公式计算：生存率（%）=（实验组OD值/对照组OD）×100%。抑制率（%）=（1-生存率）×100%。
1.4 实验分组 将NRK-52E接种在6孔板中，当细胞密度达到70%左右时进行无血清同步化处理24h，之后将NRK-52E细胞随机分为5组：（1）对照组。（2）诱导组：只添加10ng/mlTGF-β1。（3）PA干预组：10ng/ml TGF-β1+100μg/ml PA。（4）PW干预组：10 ng/ml TGF-β1+200μg/ml PW。（5）PP干预组：10ng/ml TGF-β1+200 μg/ml PW。
1.5 RT-PCR检测EMT相关基因mRNA水平的表达 PA、PW和PP分别处理NRK-52E 24 h，收集细胞，TRIZOL法提取细胞总RNA，分光光度计测定RNA浓度。取所提取的2μg总RNA逆转录成cDNA，并进行荧光定量PCR，GAPDH作为内参。E-cadherin的上游引物：AACAACTGCATGAAGGCGATCTCC，下游引物TTGACCACCGTTCTCCTCCGTAG，扩增产物长度137bp；α-SMA的上游引物：GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC，下 游 引 物：CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC， 扩增产物长度为150bp；Desmin的上游引物：AATGACCGCTTCGCCAACTACTTC， 下 游 引 物：GCTCTCGCATCTCCTCCTCGTAG，扩增产物长度为139 bp；GAPDH的上游引物：ACCACAGTCCATGCCATCAC，下游引物：TCCACCACCCTGTTGCTGTA，扩增产物长度为453 bp。
1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以（）表示，方差齐者，多组间采用one-way ANOVA，组间两两比较用LSD法；如方差不齐，采用Tamhane's T2。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PA对NRK-52E细胞增殖的影响 CCK-8结果显示，与对照组比较，低浓度的PA对NRK-52E细胞无明显的抑制作用，当浓度达到200μg/ml时，PA可显着抑制NRK-52E的增殖效应，抑制率达到56%，具有统计学意义（P＜0.05）。当PA浓度达到400μg/ml时，其对NRK-52的抑制率高达68%，较对照组差异性显着（P＜0.01）。
2.2 PW对NRK-52E细胞的增殖效应 CCK-8结果显示，与对照组比较，低浓度的PW对NRK-52E细胞无明显的抑制作用，当浓度达到400μg/ml时，PW可显着抑制NRK-52E的增殖作用，抑制率达到50%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
2.3 PP对NRK-52E细胞的增殖效应 CCK-8结果显示，与对照组比较，低浓度的PP对NRK-52E细胞无明显的增殖效应，当浓度达到12.5μg/ml和25μg/ml时，其增殖率分别达到175%和176%，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。然而，随着浓度的继续增加，其增殖作用趋于减弱。当浓度达到400μg/ml时，PP反而抑制NRK-52E的增殖效应，抑制率达到38%（P＜0.05）。
2.4 桑黄不同浓度提取物对NRK-52E细胞EMT相关基因mRNA表达的影响 基于CCK-8结果，分别选取100μg/ml PA、200μg/ml PW和200μg/ml PP用于后续的EMT干预实验。RT-PCR结果显示TGF-β1诱导组中α-SMA和desmin的表达均较正常组明显增加（P＜0.01），E-cadherin则较正常组显着降低（P＜0.01）。而经PA、PW和PP干预之后，NRK-52E细胞中的α-SMA和desmin较模型组明显降低（P＜0.01或 P＜0.05），E-cadherin 表达增加（P＜0.01 或 P＜0.05），其中PP的干预效果最佳。综上，PA、PW和PP均可抑制NRK-52E细胞的EMT作用。见图1-3。
3 讨论
图1 桑黄不同提取物对α-SMA表达的影响（与对照组比较，⋆⋆P＜0.01；与TGF-β1模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01）
图2 桑黄不同提取物对demin表达的影响（与对照组比较，⋆⋆P＜0.01；与TGF-β1模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01）
图3 桑黄不同提取物对E-cadherin表达的影响（与对照组比较，⋆⋆P＜0.01；与TGF-β1模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01）
桑黄，又称桑臣、桑耳、桑黄菇等，是寄生于桑树等阔叶树的一种药用真菌。桑黄的主要成分包括多糖、甾体、黄酮类物质、酚类物质、萜类、香豆素类物质及生物碱［4］。桑黄具有广泛的药理活性，包括抗氧化［5］、抗血管生成［6］、降血糖［7］、自由基清除［8］、免疫调节［9］和抗肿瘤作用［10］。桑黄是活血化瘀药，其子实体入药，味微苦，性寒，具有活血、化饮、补虚、清热解毒之功效。现代药理学研究表明多糖、黄酮和萜类是其主要活性成分。桑黄是一种珍贵的药用真菌，已吸引国内外越来越广泛的关注。研究证实桑黄具有抗肿瘤、抗肝纤维化和抗氧化等作用。桑黄的抗肝纤维化作用在动物实验中已得到证实。然而，桑黄是否具有抗肾纤维化作用尚未见报道。
在本研究中，首先评估了不同浓度PA、PW和PP对NRK-52E细胞增殖的影响。在此基础上，作者分别选取了100μg/ml PA、200μg/ml PW和200μg/ml PP三个对细胞无毒副作用的浓度用于后续的EMT干预实验。RT-PCR结果显示TGF-β1组中E-cadherin较正常组明显降低，而α-SMA和desmin较正常组明显增加。而经PA、PW和PP干预之后，NRK-52E细胞中E-cadherin表达较TGF-β1组明显上调，α-SMA和desmin则明显降低，其中以PP的效果最为明显，推测PP可能是桑黄中抑制NRK-52E发生EMT最有效的成分。
综上所述，桑黄不同提取物可抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生。EMT是一个错综复杂的过程，阻断其中任何一个环节均有可能抑制其进程。本文仅检测了EMT发生的下游效应因子，其具体机理尚不明确，还有待于进一步的探究。
