张美珍 李登云 胡丹兰

肺癌的发病率在所有恶性肿瘤中占比较高，且逐年增长［1-2］，其中大多数属于非小细胞肺癌。探讨肺癌发病的相关机制与寻求有效、合适的治疗药物，向来是一项重大课题。大黄素（EM）是从大黄类植物中提取的有效活性成分，研究发现其对淋巴肉癌和肺癌等具有抑制作用，是具有很高药用性的生物抑制剂［3-5］。细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）是细胞中信号传导的关键蛋白，M2型丙酮酸脱氢酶（PKM2）是ERK1/2的下游调控因子，在肿瘤相关蛋白P53的表达中发挥重要作用，而P53可以有效促进肿瘤细胞的凋亡。本研究旨在观察大黄素对肺癌细胞中ERK1/2-PKM2/P53信号通道的影响，为肺癌的临床治疗提供新的科学思路。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器 人体非小细胞肺癌细胞（ATCC）；大黄素（CAS：32507-66-7；纯度＞97%，上海同田生物技术有限公司）；DMEM培养基（高糖型）（CAS：HL12049.1，上海哈灵生物技术有限公司）；标准胎牛血清（CAS：16000-044，Gibco）；青链霉素（CAS：P1400，纯度：98%，贵州赛兰博科技有限公司）；MTT粉剂（CAS：298-93-1，上海吉凯基因科技有限公司）；细胞计数试剂盒（CAS：ZP328，Genview）；transwell小室（CAS：3415，Corning Life Sciences）二甲基亚砜（CAS：67-68-5，aladdin）；膜联蛋白APC（CAS：KA3808，上海哈灵生物技术有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（CAS：40302ES20，Merck）；酶标仪（CAS：Multiskan FC，赛默飞）；流式细胞仪（CAS：AttuneNxT，赛默飞）；荧光定量PCR（CAS：PikoReal，BIO-RAD）；Western湿电转膜仪（Trans-Blot-cell）。

1.2 实验方法 （1）细胞培养：将肺腺癌细胞制成悬液，之后置于胎牛血清培养基中，在37 ℃、5% CO2的孵箱中培养。（2）分组：将培养好的细胞分为药剂组和溶剂组。其中，药剂组按加入大黄素浓度的不同分为药剂A组（大黄素浓度50 μg/ml）、药剂B组（大黄素浓 100 μg/ml）、药剂 C 组（大黄素浓度 150 μg/ml）、药剂D组（大黄素浓度200 μg/ml）；溶剂组加入等量不含大黄素的溶剂（大黄素浓度0 μg/ml）。（3）MMT实验：取对数期细胞，稀释成3×104个/ml，接种于孔板，每孔100 μl。以培养液为空白对照，溶剂组和药剂组各亚组均设5个复孔，在设定好参数的培养箱中培养48 h之后，每孔加入20 μl MTT，等待4 h后吸出上清，每孔加150 μl二甲基亚砜，震荡，处理好样品后将流式细胞仪波长设定为490 nm进行测定，计算细胞的抑制率。（4）Transwell 细胞侵袭实验：取稀释的人工基质胶l25 μl加入transwell板上室，使胶覆盖整个聚碳酸酯膜，然后在设定好参数的培养箱中放置，使人工基质胶聚合；取对数期待测细胞，调整浓度为2×105个/ml，上室接种处理后肺癌细胞悬液，下室用初始的培养基做趋化因子；将细胞分组并置于设置好参数的培养箱中培养24 h，然后用工具擦去凝胶和膜上表面的细胞，处理完毕后进行细胞固定，结晶紫染色20 min，再使用PBS清洗多次；显微镜下计数，选取四周和中间5个方向随机范围内的细胞数，计算取平均值。（5）检测细胞凋亡实验：取对数期肺癌细胞，接种到6孔板中，每孔约2×105个细胞，置于设置好参数的培养箱中，根据细胞分组按照检测试剂盒提供的操作步骤分别处理，继续培养48 h，使用流式细胞仪检测凋亡情况，计算结果。（6）Western blot蛋白检测实验：将肺癌细胞分为溶剂组和药剂A、B、C、D四组，培养48 h，之后进行蛋白提取和蛋白定量。将样品放在沸水中加热至蛋白完全变性，拿出冷却至室温，进行电泳与转膜，转膜后进行封闭及免疫杂交，清洗好的膜用封闭缓冲液常温封闭1 h，用洗膜液3次，一抗4 ℃孵育，过夜，洗膜，二抗常温下孵育1 h，洗膜，处理完毕后，用化学发光法进行显影处理，拍照，采用ImageJ软件对实验所得条带进行定量分析，计算结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以（）表示，两两比较采用LSD-t法，多组比较采用单向方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MMT实验结果比较 随着大黄素浓度的增加，肺癌细胞的抑制率明显增加，呈浓度依赖性（P＜0.05）。见表 1、图 1。

表1 各组MMT实验结果比较（n=5）

图1 大黄素浓度与抑制率变化折线图

2.2 各组肺癌细胞侵袭能力比较 药剂组侵袭细胞的数量明显低于溶剂组，药剂组大黄素浓度与侵袭细胞数呈负相关（P＜0.05）。见表2、图 2。

表2 肺癌细胞侵袭能力比较（n=5）

图2 transwell实验肺癌细胞结晶紫染色

2.3 各组细胞凋亡水平比较 药剂四组肺癌细胞的凋亡率高于溶剂组，大黄素浓度与凋亡率呈正相关（P＜0.05）。见表 3、图 3。

表3 细胞凋亡水平比较（n=5）

图3 各组肺癌细胞细胞凋亡图

2.4 Western blot实验结果 药剂组各组ERK1/2、PKM2蛋白的表达水平更低，P53蛋白的表达水平更高；大黄素浓度与ERK1/2、PKM2蛋白的表达呈负相关（P＜0.05），与P53蛋白的表达呈正相关（P＜0.05）。见表4、图4。

表4 各组蛋白表达水平比较（n=5）

图4 各组蛋白表达水平

3 讨论

正常情况下，细胞的增殖受其自身限制，且侵袭转移能力较差，通过细胞凋亡维持正常细胞内环境的稳定［6］。而肿瘤细胞的细胞分裂不受约束，侵袭与转移能力急速增强，细胞异常活跃，凋亡因子明显受到抑制，导致肿瘤细胞难以控制［7］。常见抗肿瘤药的作用机制有以下几种：①干扰核酸进行生物合成；②破坏DNA结构和功能；③嵌入DNA中干扰转录过程；④干扰影响蛋白质合成；⑤调节体内激素产生抑制作用。抗肿瘤药通过以上机制抑制肿瘤细胞的作用无差别，同时均能较大程度地损害正常细胞。大黄素是一种从自然植物中提取的蒽醌类化合物，通过嵌入干扰和生物还原等作用机制，对肿瘤细胞具有较高的特异性，且本身毒性较低，对正常细胞影响很低。大黄素吸收进入人体后，约一半剂量去向不明，在肌肉组织及脂肪中均未能检出，可能与它在体内的脂溶性相关，在肝组织中的剂量远远多于其他体内组织，排泄量为吸入剂量的2.7%，主要由粪便排出。所以，大黄素的浓度与剂量在体内的代谢转化、吸收排泄均有据可依，通过调整大黄素的浓度与剂量，有助于个体差异性的临床治疗。

ERK1/2位于RAS/RAF/MEK/ERK通路下游，当RAS/RAF/MEK/ERK通路发生异常时，细胞的正常功能会出现障碍，甚至发生癌变。作为RAS/RAF/MEK/ERK通路下游的“最终管理器”，靶向抑制ERK1/2有望用于治疗通路异常激活造成的癌变，对于产生RAF或MEK抑制剂耐药的患者也可能有效。ERK1/2信号途径可被多种刺激因子激活，与细胞的周期活动密切相关［8-10］，磷酸化是其发挥生理功效的关键［11-12］。相关实验研究发现，加入抑制ERK1/2活化后，细胞中原癌基因的表达会相应减少，通过调控ERK1/2可有效减少细胞的癌变［13-14］。PKM2和P53是ERK1/2通路的下游调控因子，PKM2可促进肿瘤细胞的活跃［15］，P53有助于细胞凋亡，进而抑制肿瘤细胞［16-17］。

本研究结果表明，药剂组中肺癌细胞的增殖能力与溶剂组相比均降低，细胞侵袭能力明显下降，细胞凋亡率增加，且效果和大黄素浓度明显相关，说明大黄素可以有效抑制肺癌细胞的增殖能力。在分子水平上，药剂组肺癌细胞中ERK1/2和PKM2蛋白的表达低少于溶剂组，且与大黄素浓度相关，说明大黄素可以抑制ERK1/2-PKM2信号通路，降低ERK1/2的磷酸化，降低PKM2蛋白的表达，浓度越高则作用效果越明显，提示大黄素的作用靶点是ERK1/2、PKM2信号通路。同时，大黄素会促进肺癌细胞中P53的高表达，表达水平和大黄素浓度呈正相关，说明大黄素可通过诱导P53高表达促进肺癌细胞的凋亡。

综上，大黄素可以有效抑制肺癌细胞的增值、侵袭，促使肺癌细胞凋亡。其作用机制可能是抑制ERK1/2的磷酸化，阻断ERK1/2-PKM2信号通路，诱导P53表达，最终达到抑制肺癌细胞的目的。不过，本研究仅探讨了大黄素的体外抗肿瘤作用机制，作用效果未与同类型药物进行比较，大黄素及其衍生药物能否成为治疗非小细胞肺癌的特效药，还需要更多的对比研究、动物及人体试验进一步验证。