郑如莲 夏武杰 杨鹏麟

垂体中叶素（Intermedin，IMD）是由ROH等[1］证实的一种新的降钙素（calcitonin，CT）/降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）家族。TAKEI等[2］发现CGRP家族的新成员肾上腺髓质素2（adrenomedullin，ADM2），被认为是同一种肽。IMD/ADM2在机体中作用广泛，能降压，改善心功能，减少外周血管阻力，增加心输出量，在内环境稳态调节和中枢神经调节及高血压、心肌缺血、心功能衰竭和肾功能衰竭等疾病过程中有重要的生理、病理学作用。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，体重（200±20）g，由上海斯莱克实验动物中心提供。兔抗鼠IMD/ADM2由美国Phoenix Pharm Inc.提供，大鼠抗鼠α-tubulin由美国Santa Cruz. Inc提供。

1.2 方法 （1）“两肾一夹”肾性高血压大鼠模型的复制：大鼠随机分为两组，模型组大鼠，称重，麻醉，固定，消毒后，开腹，暴露肾脏及肾动静脉，分离动静脉，用直径0.3 mm的银针贴近肾动脉靠近肾脏处，用3号线打结固定后取走银针；术毕，逐层缝合腹膜与皮肤，术后正常进食与喂水。（2）大鼠平均颈动脉压（mCAP）、左心室舒张末压（LVEDP）以及左心室内压最大上升/下降速率测定：大鼠饲养8周后，称重，麻醉，固定，消毒后，颈正中切口，分离左颈总动脉。行颈总动脉插管，记录SBP，DBP，mCAP；心脏舒缩时左心室内的压力变化图和左心室内压最大上升/降速率，LVEDP。放血处死动物，取出心脏，分别称取左心室加室间隔的重量（LVM），LVM/BW作为左心室肥大的指标。（3）RT-PCR法检测肾脏组织IMD/ADM2的mRNA的表达：用Trizol一步法提取组织总RNA，用核酸蛋白测定仪测260 nm及280 nm处OD值，以检测其浓度和纯度；OD260/OD280比值应为1.6～2.0。用DEPC水调整各样本的浓度，使其终浓度为2 mg/mL；进行逆转录反应。PCR扩增：用于扩增的PCR引物序列，扩增条件为预变性（95℃ 5 min）→变性（94℃ 30 s）→退火（30 s）→延伸（72℃ 40 s）热循环n次→72℃ 5 min。-20℃保存备用，见表1。产物进行电泳检测分析。（4）免疫组化法检测肾脏组织IMD/ADM2定位及半定量：①标本前固定处理：每组各随机选取3只大鼠，大鼠右心耳剪个缺口，将含有1,000 U肝素0.9%氯化钠溶液快速注入大鼠左心室内，通过体循环从右心耳处流出。20 min后，换成500 mL 4%多聚甲醛继续滴注，直到大鼠全身出现僵硬，遂可停止滴注。取出肾脏，将其环切之后标本保存于4%多聚甲醛中，用于组织脱水、包埋、切片，待测IMD/ADM2蛋白水平。②用两步法检测肾脏IMD/ADM2免疫组化：肾脏组织石蜡切片烘片，脱蜡水化，高压修复抗原，0.03%H2O2-甲醇去除过氧化物酶，封闭抗原，滴加IMD/ADM2一抗（1∶100），4℃过夜。次日37℃复温45 min，滴加二抗（60μL），37℃ 30 min，PBS冲洗，DAB显色，复染，脱水，透明，封片，读取每个视野阳性区域及累积光密度。

表1 IMD、CL、RAMPs、β－actin引物设计及扩增条件

2 结果

2.1 两组大鼠颈部有创血压及左心室指数比较 模型组SBP，DBP，mCAP、LVEDP、LVM/WT和左心室内压最大上升/下降速率与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组大鼠颈部有创血压及左心室指数比较（±s）

表2 两组大鼠颈部有创血压及左心室指数比较（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

组别 n LVEDP（mmHg） 左心室内压最大上升速率（mmHg/s） 左心室内压最大下降速率（mmHg/s） SBP（mmHg） mCAP（mmHg） LVM/WT（mg/g）对照组 9 -9.68±7.14 7,173.17±299.12 6,115.94±274.97 137.13±2.87 119.15±2.68 1.85±0.32模型组 9 22.81±4.05** 13,010.25±2,030.88** 7,626.40±964.64** 178.92±10.30** 145.53±22.64** 2.06±0.14*

2.2 肾脏组织IMD/ADM2的mRNA表达及免疫组化的累积光密度比较 模型组肾脏组织IMD/ADM2免疫组化的累积光密度比对照组明显升高（P＜0.01），且主要在肾小动脉血管平滑肌细胞及肾小管（近曲小管、远曲小管、集合管）细胞的细胞核中表达。见表3。

表3 肾脏IMD/ADM2的mRNA及蛋白表达变化（±s）

表3 肾脏IMD/ADM2的mRNA及蛋白表达变化（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；**P＜0.05

组别 mRNA表达 累积光密度对照组 1.55±0.65 1.59±1.85模型组 4.80±2.44** 26.89±14.08**

3 讨论

降钙素原（procalcitonin，PCT）已经在临床中广泛使用，已证实对感染性疾病有一定的预测作用，PCT水平是ICU 30 d死亡的独立危险因子，PCT水平越高，死亡率越高，在无发热、无器官衰竭或脓毒症的低龄患者中更为有益[3］。

既往研究已经证实，给大鼠静脉注射合成的ADM2显示出有力的、持久的降压效应，降低大鼠平均动脉血压，且呈剂量依赖性，其降压效应持续较心房利钠肽持久[4-7］。然而正常离体大鼠心脏中，灌注ADM2后不影响心率，但能提高心脏功能和扩张冠状动脉。但ADM2 1-53干预能明显改善由缺血/再灌注引起的心脏功能抑制和心动过缓，并降低缺血再灌注心肌中乳酸脱氢酶活性和丙二醛的生成、血浆总蛋白及肌红蛋白含量[8］。

原发性高血压是一种多基因、多因素、复杂异质性的疾病，降钙素（CT）/CGRP家族肽和线粒体[8-10］在调节血管的各个方面起到关键的作用，为原发性高血压的早期诊断和干预提供理论依据。在自发性高血压大鼠和一氧化氮合酶[11］抑制剂左旋硝基精氨酸诱导的高血压大鼠模型中，IMD/ADM2在血浆和组织中含量均增加，表明在两种高血压动物模型中，IMD/ADM2在高血压伴心肌肥厚的病理过程中发挥重要作用，但“两肾一夹”高血压模型中是否有相同的改变仍有待进一步研究。

TAKEI等[12］通过给大鼠静脉注射ADM2，无论是正常WKY大鼠，还是自发性高血压大鼠（SHRs），肾血流量均明显增加而肾小球滤过率不变，导致肾小球滤过分数下降，胶体渗透压降低，肾小管周围毛细血管内蛋白浓度下降，近曲小管重吸收水、钠受抑制，有利尿、促尿钠排泄的作用，推测ADM2不仅通过扩血管作用改善血供，且也通过调节肾脏微循环发挥作用。FUJISAWA等[13］实验研究证实，在大鼠肾内动脉连续注入IMD后肾血流量增加，提示IMD有扩张肾血管的作用。ADM能抑制肾间质纤维化，有些研究推测IMD也有减轻单侧输尿管梗阻（UUO）导致的肾脏纤维化的作用，其机制可能与抑制肾组织局部氧化应激有关，IMD有可能成为肾脏疾病防治的新靶点。

本实验中用逆转录PCR的方法测定的肾脏的IMD/ADM2 mRNA水平发现模型组IMD/ADM2水平比对照组升高，提示IMD/ADM2转录水平增加可能是引起IMD/ADM2在心肌组织中含量蛋白增加的原因。同时用免疫组化的方法检测IMD/ADM2在肾性高血压时肾脏组织中的表达时发现，模型组IMD/ADM2蛋白含量比对照组明显升高。且两组大鼠IMD/ADM2肾脏含量的升高与两组LVM/WT比呈显着正相关，作者认为这是IMD/ADM2在肾性高血压的肾脏病变中起保护作用的体现。在高血压状态下，由于调节通路的障碍及机体的某种器官损伤导致机体代偿性反应处于失衡状态，从而导致IMD/ADM2出现绝对或相对不足。

综上所述，IMD/ADM2为预防和治疗心血管疾病提供了新靶点，其生理和病理意义及其在高血压的靶器官损害过程中的意义还需进一步研究。