Xpert MTB/RIF技术在肺结核患者结核分枝杆菌鉴定及利福平耐药检测中的应用价值

赵丽丽 许玲英 倪慧群 钟东方

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的传染性疾病，并通过空气在人与人之间传播。目前我国每年新发结核患者约90 万，是全球结核病高发病率国家之一，结核防控形势十分严峻［1］。结核病早期预防及时检测、规范治疗是关键，准确快速检测结核病，包括涂片阴性结核病和耐药结核病，对于改善患者预后提高治愈率、降低死亡率、降低耐药性并减少结核病传播至关重要。结核分枝杆菌培养通常被认为是MTB 诊断的金标准，也是比例法进行细菌药敏检测的第一步。然而，培养是一个相对复杂和缓慢的过程，其中固体培养通常需要2～4 周才能获得结果，而液体培养也需要数天时间且容易受到污染。Xpert MTB/RIF 可同时检测MTB 和利福平耐药性，是目前临床一线对肺结核早期发现、快速诊断的重要检测方法，在结核病快速诊断以及耐药结核规范治疗过程中具有重要意义，世界卫生组织已经推荐该技术用于肺结核痰液标本检测［2］。本文探讨Xpert MTB/RIF 技术在肺结核病快速诊断及耐药检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2019 年5 月至2021 年5 月海盐县人民医院596 例初诊疑似肺结核患者痰液样本。肺结核临床诊断标准：痰涂片阳性，胸部X 线检查与肺结核相符的病变，并符合下列条件之一：①伴有咳痰、咳嗽、咯血等可疑症状，②结核菌素试验呈强阳性，③抗结核抗体检查阳性［3］，临床诊断结合病理学或病原学培养结果作为肺结核确诊依据。纳入标准：胸部影像学检测类似肺结核特征，有相应症状，治疗前可获得合格痰标本。排除标准：标本污染，非肺结核或肺外结核患者。去除培养污染3 例，最终纳入593 例。其中男356 例，年龄（60.2±16.9）岁；女237 例，年龄（55.4±16.6）岁。593 份标本分别做荧光染色镜检、Xpert MTB/RIF 检测、液体法培养及培养阳性菌株结核菌鉴定和比例法药物敏感性试验。

1.2 方法 （1）仪器与试剂：Xpert MTB/RIF 系统及其配套试剂盒、痰标本处理液（美国Cepheid 公司），对硝基苯甲酸（PNB）培养基、噻吩-2-羧酸肼（TCH）培养基、金胺“O”荧光染液（珠海贝索生物技术公司），BACTEC MGIT320 系统及配套消化液、添加剂、培养基（美国BD 公司），结核分枝杆菌抗原检测试剂盒（杭州创新生物检控技术有限公司）。（2）直接涂片荧光染色法：荧光染色将固定后的痰涂片用金胺“O”染液染色10 min 后水洗，再用酸性酒精溶液脱色1～2 min 后水洗，重复脱色至外观无黄色为止，用复染液复染1 min后水洗待干镜检。荧光染色镜检结果分级报告标准参照《肺结核诊断WS 288-2017》。（3）Xpert MTB/RIF 检测技术：前处理管加入1 mL 痰液和2 倍处理液，旋紧强力震荡20 s 后室温静置15 min 后吸取2 mL 充分液化痰液，加入Cartridge 反应盒仪器检测，2 h 后可读取MTB鉴定和利福平耐药性结果。Xpert MTB/RIF 技术检测结核杆菌结果以高、中、低、极低和未检出5 个量级来表示；利福平耐药性检测结果为检出或未检出表示。（4）液体培养法及结核菌鉴定和药敏试验：取1 mL 痰液经N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠消化处理，强力旋涡振荡后室温静置，加入磷酸盐缓冲液离心15 min 弃上清液制备成悬浊液，取0.5 mL 接种于培养管，采用BACTEC MGIT320 系统进行培养，培养阳性结果涂片抗酸染色镜检确认，同时采用MTB 抗原检测试剂盒鉴定菌种。采用比例法对培养阳性MTB 菌株进行抗结核药物检测［4］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件。计数资料采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。以临床确诊141 例肺结核患者为金标准，计算涂片荧光染色法、Xpert MTB/RIF 及液体培养法敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率。Xpert MTB/RIF 法与比例法检测RIF 耐药一致性采用Kappa 检验，Kappa 值≥0.75 为研究方法与参照标准高度一致，0.40 ≤Kappa值＜0.75 为基本一致，Kappa 值＜0.40 为不一致。

2 结果

2.1 肺结核确诊患者临床特点 593 例初诊疑似结核患者中141 例确诊为肺结核患者，年龄14～92（58.41±21.09）岁，61～80 岁年龄段占37.6%。男性（75.2%）高于女性（24.8%），94.3%患者有肺部影像学改变，98.0%患者为继发性肺结核病，见表1。

表1 141例确诊肺结核患者临床特点分析

2.2 三种方法检测MTB 的效能和一致性比较 见表2-3。

表2 三种不同方法检测MTB结果

表3 三种方法以临床确诊肺结核患者为金标准的检测效能分析

2.3 三种方法鉴定MTB 结果不一致原因分析 三种方法检测结果不一致其中154 例液体培养分离出分枝杆菌，140 株细菌结果鉴定为结核分枝杆菌复合群（MTBC），14 例检出非结核分枝杆菌（NTM），14 例NTM对应Xpert MTB/RIF 法检测为阴性，涂片荧光染色均为阳性。1 例荧光染色及Xpert MTB/RIF 阳性而培养阴性考虑菌量少而未培养出菌落，2 例仅荧光涂片阳性且菌量少可能为污染或为其它种类细菌，56 例涂片阴性肺结核Xpert MTB/RIF 与培养法均检出MTB。

2.4 Xpert MTB/RIF 法检测与比例法药敏结果比较 140 株液体培养阳性MTB 菌株进行比例法药敏试验利福平耐药率为5.7%，Xpert MTB/RIF 法检测利福平耐药率为5.0%。Xpert MTB/RIF 法检测利福平耐药率敏感性87.5%、特异性100%、准确性99.3%，与比例法药敏性试验结果一致性高Kappa 值为0.93。140 例结核分枝杆菌液体培养阳性患者MTB 利福平耐药率女性与男性比较差异无统计学意义（χ2=0.71，P＞0.05）。见表4-5。

表4 140例结核分枝杆菌液体培养阳性患者Xpert MTB/RIF与比例法药敏结果比较

表5 结核分枝杆菌培养阳性患者利福平药敏结果与性别相关性［n（%）］

3 讨论

目前检测肺结核方法，包括痰液涂片、痰液培养以及分子生物学检测。传统涂片法检测结核菌主要是抗酸染色或荧光染色显微镜下寻找病原体，但涂片法存在一定局限性如对标本的含菌量要求高、标本取材影响、是否开放性肺结核、涂片灵敏度、非结核分枝杆菌干扰等，导致其诊断肺结核病的敏感度较低，同时涂片操作也存在一定生物安全危险。传统结核菌药敏试验基于病原菌培养基础上的检测，结核分支杆菌生长分裂一代约15～20 h，以结核分枝杆菌生长为基础的培养方法和比例法体外药敏试验虽然结果可靠，但需要4～6 周，因此无论是痰液涂片镜检还是结核菌培养及药敏均存在延误结核病诊断。目前分子生物学检测方法有其快速灵敏的优点，同时检测方法日趋成熟，有效弥补传统结核分枝杆菌培养等检测方法的缺陷［5］。《WS288-2017 肺结核诊断》标准已将分子生物学检查阳性作为肺结核病原学诊断依据之一，其中Xpert MTB/RIF 作为一种基于实时荧光定量核酸扩增检测技术可同时实现MTB 和利福平耐药性检测已经被WHO 推荐使用［6］。

本研究对疑似肺结核患者痰液样本同时采用涂片荧光染色法、Xpert MTB/RIF 法和液体培养法检测，阳性率分别为16.7%、23.4%和23.6%，与张青等［7］研究结果一致。141 例临床确诊肺结核患者中男性高于女性，98%患者继发性肺结核病。以临床确诊肺结核为金标准，Xpert MTB/RIF 法与液体培养法检测结核菌结果有较高的一致性kappa 值均>0.9。但Xpert MTB/RIF 法检测MTB 准确度（99.7%）高于荧光染色法（87.5%），差异有统计学意义（P＜0.05）与徐东芳等［8］研究结果一致。菌株鉴定结果表明，涂片荧光染色阳性标本中有14 例液体培养结果鉴定为NTM 但Xpert MTB/RIF 检测为阴性，Xpert MTB/RIF 分子法较为准确的鉴定结核分枝杆菌，提高涂片染色阳性样本中MTB 检测的特异性。494 例涂片阴性患者痰液样本中Xpert MTB/RIF 技术检测MTB 的敏感性、特异性分别为96.6%和99.5%，与液体培养法比较差异无统计学意义（P＞0.05），对于涂片荧光染色阴性样本Xpert MTB/RIF 技术有较高的敏感性和特异性，可以较好的补充痰涂片阴性患者肺结核检出率，因此Xpert MTB/RIF 既可作替代涂片镜检的初始测试，也可作为涂片阴性肺结核的附加测试［9］。

结核菌常见耐药为异烟肼和利福平，目前对MTB耐药检测常用传统比例法药敏试验，然而该方法基于MTB 液体培养，再进行细菌药敏试验。由于MTB 生长较慢检测周期长，从而影响患者及时治疗，部分耐药菌产生导致患者错过最佳治疗时机。文献提示多数利福平耐药结核菌株是由rpoB 基因核心区域上81bp 耐药决定区突变所致，突变后细菌RNA 聚合酶的β-亚基结合位点不能与利福平药物有效结合从而出现耐药性［10］，同时多数结核菌对利福平耐药株也表现为对异烟肼耐药形成多重耐药表型，因此rpoB 关键基因突变是多重耐药结核菌分子检测重要靶点，临床中对利福平分子突变检测进而推测药物耐药性可作为耐多药结核菌的重要检测指标［11］。同时Xpert MTB/RIF 分子检测方法具有灵敏度高、检测时间短、封闭检测体系、操作安全等特点成为推荐检测方法［12］，以比例法药物敏感性试验结果为金标准，比较Xpert MTB/RIF 方法检测利福平药敏结果，其敏感性为87.50%、特异性为100%，两种方法比较差异无统计学意义（P＞0.05），检测结果有较高的一致性，Kappa 值0.93。

综上所述，Xpert MTB/RIF 技术操作简单，敏感性和特异性较好，在肺结核中诊断价值较高，具有能同时快速鉴定MTB 和检测RIF 耐药性的特点，尤其是在耐多药MTB 的筛选中具有重要价值，可为基层临床快速选择诊疗方案提供有效参考。