李佳华 曹晨曦 陈振伟

结直肠癌（CRC）是导致全球癌症患者死亡的第二大癌症［1］。针对于结直肠癌患者的治疗主要包括内镜和手术切除、化学治疗、靶向治疗、放疗和免疫治疗等。30%～50%的患者对结直肠癌进行根治性治疗后出现复发［2］。结直肠癌的诊断主要依靠影像学检查、肿瘤标志物和组织活检。但影像学检查昂贵费时且发现时较晚，传统肿瘤标志物则具有滞后性且灵敏度和特异度均较低。病理活检是诊断结直肠癌的“金标准”，但具有侵入性、组织取样受病灶位置所限的特点，单次活检通常不能反映结直肠癌的异质性，尤其是对于伴有远处转移的患者。近年来，液体活检逐渐兴起，与组织活检相比，液体活检技术能更好反映肿瘤异质性，便于重复检测，还可以在分子水平上进行全面的实时监测，了解患者在疾病全过程中的肿瘤负荷和基因变化，也有利于后续治疗方案的选择和调整，具有广泛的临床应用价值及应用前景。

1 液体活检的概念

“液体活检”一词是由PANTEL和ALIX-PANABIERES最先提出的，用以定义血液中反映肿瘤特定信息的标志物［3］。液体活检主要通过无创或微创的方式对患者的血液、粪便、尿液和脑脊液等体液进行取样，其检测对象主要是循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌体等。液体活检克服了肿瘤异质性，可以实时监测肿瘤进展、复发或治疗反应［4］。随着检测技术的逐渐成熟，液体活检有望进入一个新时代。

2 检测对象及技术

2.1 循环肿瘤细胞（CTC） CTC是指在肿瘤发生发展过程中，从肿瘤原发灶或转移灶脱落并进入循环系统的肿瘤细胞，能在DNA、RNA和蛋白质水平上提供肿瘤相关信息［5］。然而，当CTC脱离病灶后易发生表型变化，易受到机械因素、药物因素和免疫系统的影响而被损伤破坏，仅有少数细胞可以存活，且大小、形态不一，难以被检测和计数［6］。

目前CellSearch仪器是当今用于富集和分析CTC的主要方法，已获得美国食品和药物管理局（FDA）的授权，可用于结直肠癌中的CTC检测［7］。随着技术的进步，纳米技术提高了检测CTC的灵敏度和特异性。在此基础上，有研究者构建了一种具有特异性捕获和非破坏性释放癌细胞双重功能的生物芯片，该芯片可以高效捕获的CTC，且对细胞活力损伤小［8］。此外，一种可以快速检测CTC的微流控系统应运而生。与CellSearch系统相比，该系统具有血量、时间和成本的优势，且对细胞活性无影响［9］。LEE等［10］回顾了基于纳米技术的液体活检的应用，进一步证明在肿瘤监测和治疗的临床实践方面具有可行性。

2.2 循环肿瘤DNA（ctDNA） 细胞游离DNA（cfDNA）是细胞坏死和凋亡释放到外周血中并游离于细胞外的高度片段化的DNA片段，可存在于人体的各种体液中，如血液、粪便、尿液、脑脊液和胸腔积液［11］。ctDNA是主要来源于肿瘤细胞死亡过程中释放到人体血液循环中，且具有肿瘤特异性的分子特征、编码肿瘤细胞的DNA片段，属于cfDNA的一种类型，约占0.01%～5.00%［12］。虽然ctDNA具有2 h的半衰期，但其在进入血液循环后会迅速被清除。

目前检测ctDNA的技术包括聚合酶链式反应（PCR）技术和二代测序（NGS）技术。PCR技术包括等位基因特异性突变扩增系统PCR（ARMS）、肽核酸钳制PCR、数字PCR（dPCR）和微珠乳化扩增技术等［13］。NGS与PCR技术不同，NGS可以检测大量突变基因，其能同时对上百万个DNA模板的序列进行测序，并且能够快速分析多个基因组靶点和突变［14］。在最近的一项荟萃分析中，比较dPCR、ARMS和NGS对结直肠癌患者cfDNA中KRAS突变的诊断准确性，二代测序总体上有更高的准确性［15］。

2.3 外泌体 外泌体是一种超微膜性囊泡，具有脂质双膜，可由淋巴细胞、肥大细胞以及肿瘤细胞分泌，广泛存在于各种体液中，如血液、尿液、唾液、腹腔积液等［16］。外泌体可携带多种生物活性物质，包括蛋白质、核酸和脂质等物质，这些物质参与外泌体的抗原提呈、膜转运和融合，同时也参与较多生理、病理过程［17］。在肿瘤的发生发展中，肿瘤细胞来源的外泌体可促进肿瘤微环境形成，同时增强肿瘤的侵袭与转移能力［18］。

目前外泌体的提取方法主要基于物理学（密度和大小）和生物学特性等，常用的有离心法（差速离心法、超速离心法、密度梯度离心法）、尺寸排阻色谱法、免疫亲和捕获法和沉淀法等［16］。除分离方法外，外泌体检测方法还包括扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹法（WB）、表面等离子体共振法（SPR）、动态光散射法（DLS）、纳米颗粒跟踪分析法（NTA）等［17-18］。

3 临床应用

3.1 早期诊断 早期诊断结直肠癌可指导临床及时改变治疗策略，延长生存周期。目前结直肠癌的诊断方法主要依靠影像学检查、传统肿瘤标志物和组织活检，但上述方法具有各自的局限性，需要一种能够早期诊断结直肠癌并实时监测肿瘤复发、转移或治疗效应的方法。有研究者通过CellMax仿生平台检测循环肿瘤细胞（CTC）对结直肠癌进行早期筛查，与结肠镜检查相比，在检测结直肠癌方面表现出高灵敏度和特异性，进一步表明CTC对结直肠癌早期诊断具有重要价值［19］。此外，特定基因的异常甲基化对结直肠癌的早期诊断有重大意义。cfDNA中的甲基化Septin9基因位于染色体17q25.3，广泛存在于人体细胞中，与结直肠癌的发生发展密切相关。有研究者通过回顾性分析结肠癌、癌前病变患者及健康对照者Septin9基因甲基化、粪便隐血试验（fecal occult blood test，FOBT）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的ROC曲线，发现Septin9甲基化、FOBT、CEA以及联合三者检测的AUC为 0.8129，0.7381，0.7744，0.9127，Septin9甲基化对于CRC患者的诊断效能相对于FOBT和CEA较高，且Septin9联合FOBT、CEA的诊断效能最高［20］。在外泌体方面，ZHENG等［21］通过比较不同临床分期的结直肠癌患者的miRNA水平发现miRNA－19a－3p可用于早期检测结直肠癌。此外，结直肠癌患者血液循环中miR-27a，miR-130a，miR-23a和miR-301a的表达明显增加，miR-23b，miR-99b-5p和miR-150-5p水平则显着下调，可作为结直肠癌早期检测和预后的无创指标［22］。

3.2 指导治疗 与组织活检相比，液体活检技术是一种非侵入性实时活检方法，可在分子水平上进行全面的实时监测，了解患者在疾病全过程中的肿瘤负荷和基因变化，也有利于治疗方案的及时调整，避免无效治疗和过度治疗。有研究共纳入455例Ⅱ期结肠癌患者，随机分组，302例为ctDNA指导的管理组，153例为标准管理组，中位随访时间为37个月。ctDNA指导组中接受辅助化疗的患者百分比低于标准管理组（15%：28%；RR：1.82；95%CI：1.25～2.65）。ctDNA指导管理组的2年无复发生存率（recurrence-free survival，RFS）不低于标准管理组（93.5%VS.92.4%；绝对差异1.1%；95%CI：-4.1～-6.2）。接受辅助化疗的ctDNA阳性患者的3年RFS为86.4%，而未接受辅助化疗的ctDNA阴性患者为92.5%（HR：1.83；95%CI：0.79～4.27）。ctDNA对于Ⅱ期结肠癌的辅助化疗有一定的指导作用，在不影响患者RFS的前提下，减少辅助化疗的使用，使治疗更精准和个体化。此外，CTC的表型特征可用于评估肿瘤治疗相关标志物，如PD-L1。RAIMOND等［23］在治疗前和治疗开始后4周和8周对结直肠癌患者纵向采集血样，应用多参数流式细胞术测定CTC水平，结果显示CTC的PD-L1的表达情况可作为一种非侵入性实时活检方法用以预测瑞戈非尼对转移性结直肠癌患者的疗效。

3.3 判断预后 液体活检可预测肿瘤患者的预后。一项荟萃分析纳入3,129例结直肠癌患者，结果显示CTC阳性预示疾病的快速进展和较高的不良存活率。进一步亚组分析表明，CTC阳性患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）也较短［24］。国内一项前瞻性队列研究纳入149例结直肠癌患者，通过比较患者的CTC计数和临床病理特征后发现，随着肿瘤分期的增加，CTC的数量也增加，CTC计数与T分期、N分期和M分期均具有显着相关性。亚组分析的结果表明，CTC阳性组随着T分期的递增，生存曲线和风险评估曲线的变化加快，进一步表明CTC可能与肿瘤的组织胚胎学位置、淋巴结转移和浸润深度有关。监测CTC对评估临床分期和预后具有重要价值。此外，ctDNA在结直肠癌预后方面也有一定的预测作用。KOBAYASH等对因孤立性可切除的结直肠癌肝转移患者完成首次肝切除前，进行ctDNA分析，其中80%患者体液中ctDNA阳性。ctDNA阴性患者中，在39.0个月的中位随访期内，仅1例复发，无一例死亡。ctDNA阳性患者的RFS明显短于ctDNA阴性患者（HR：7.6；P=0.02）。ctDNA阳性患者的OS也短于ctDNA阴性患者，但差异无统计学意义（P=0.14）［25］。除CTC、ctDNA外，外泌体也可以反映预后情况。外泌体CPNE3蛋白，是一种钙依赖性的膜结合蛋白，参与细胞信号传导及膜泡运输。通过研究发现CRC患者外泌体CPNE3水平高于健康对照组（P＜0.001），晚期CRC患者血浆外泌体CPNE3水平升高更为显着（P＜0.001），有远处转移的CRC患者血浆外泌体CPNE3水平明显高于无远处转移的CRC患者（P＜0.001），水平较低的结直肠癌患者无病生存期（DFS）和总生存期（OS）明显优于外泌体CPNE3水平较高的患者（P=0.033）。这些结果表明，CRC患者外泌体CPNE3水平升高，尤其在TNM分期较晚或远处转移的患者中更加突出。除此之外，外泌体长非编码RNA（LncRNA）在结直肠癌预后方面的研究也越来越多。LncRNA是长度＞200个核苷酸的不编码蛋白质的RNA，在多种癌症的发生发展中发挥重要作用，可以用作不同类型肿瘤中的潜在生物标志物。国内有研究者通过构建基于铁死亡相关lncRNA的结直肠癌预后风险评分公式和综合预后模型，结果显示构建的风险评分公式优于传统肿瘤分期，风险评分高的CRC患者预后更差，免疫细胞浸润、基质评分、PD-L2表达水平较高，对氟尿嘧啶的耐药性较低［26］。因此，通过液体活检有利于CRC患者的预后评估及治疗决策。

3.4 复发监测 对于术后或辅助治疗后的结直肠癌患者，ctDNA能否取代传统检查方法（如结肠镜检查、CT检查等）进行复发监测，已经引起越来越多的注意。有研究者利用多标记DNA甲基化液体活检技术对结直肠癌患者进行监测，发现70%的结直肠癌患者在复发前可检测到ctDNA，且比CT检查提前8个月［27］。HENRIKSEN等［28］对168例Ⅲ期结直肠癌患者进行多中心队列研究，结果表明结直肠癌治疗后每3个月进行一次ctDNA分析，与CT检查相比，发现CRC复发的中位提前时间为9.8个月。此外，在一项前瞻性多中心队列研究中，研究者对Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者血浆ctDNA进行分析，在术后30 d，ctDNA阳性患者复发的可能性是ctDNA阴性患者的7倍。同样，ctDNA阳性患者在辅助化疗（assessing adjuvant chemotherapy，ACT）后可能复发。常规治疗后，ctDNA阳性患者在监测期间复发的可能性是ctDNA阴性患者的＞40倍（HR：43.5；95%CI：9.8～193.5；P＜0.001）。因此，ctDNA可用于结直肠癌的危险度分级、指导辅助化疗和早期复发的监测。

4 小结与展望

目前结直肠癌诊断的金标准仍是组织活检，但组织活检具有侵入性，且有组织取样受病灶部位限制、单次活检不能反映出所有病灶的异质性等不足之处。液体活检为结直肠癌临床诊疗开辟了一条新途径。与传统检测方法相比，液体活检从患者血液和其他体液提取生物标志物，具有微创或无创、可重复、可动态监测等优势。通过液体活检，可以在分子水平上进行全面的实时监测，了解患者在疾病全过程中的肿瘤负荷和基因变化，也有利于后续治疗方案的调整，具有广阔的应用前景。

虽然液体活检对于结直肠癌诊疗方面表现一定的优越性，但液体活检的普及仍面临不少挑战：（1）液体活检的检测技术尚不成熟，从结直肠癌患者收集的CTC和ctDNA水平通常较低。同时存在信息不完整、基因错配等现象以及检测成本较高，因此需要对检测技术进一步优化。（2）缺乏临床验证和统一标志，需要大量多中心、更具前瞻性的长期临床研究进一步明确。（3）肿瘤诱导血小板（TEP）和细胞微粒等其他肿瘤标志物尚待进一步研究。相信随着技术的进步，液体活检将在临床诊疗中广泛应用。