张志勇 杨水珍
二苯乙烯苷对低氧肺动脉平滑肌细胞增殖的影响
张志勇 杨水珍
目的 探讨二苯乙烯苷对低氧肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响及其机制。 方法 SD大鼠PASMCs经低氧及TSG干预24h后， CCK-8检测细胞增殖及TSG的细胞毒作用，流式细胞仪分析细胞周期，实时定量PCR(RT-PCR)检测HIF-1α mRNA的表达，酶标仪检测活性氧(ROS)的产生。结果 二苯乙烯苷能够抑制低氧PASMCs增殖，阻滞细胞周期于G0/G1～S期，并且实验浓度的二苯乙烯苷无明显细胞毒作用，进一步的研究发现二苯乙烯苷能够抑制HIF-1α mRNA的表达及ROS的产生。结论 二苯乙烯苷可抑制低氧PASMCs增殖，其机制可能与抑制HIF-1α mRNA的表达及ROS产生有关。
低氧 肺动脉平滑肌细胞 二苯乙烯苷 增殖
低氧肺血管结构重构是慢性低氧肺动脉高压的重要病理生理基础，其对低氧肺动脉高压的发生、发展以及预后具有重要意义。低氧肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的异常增殖、迁移以及细胞外基质的异常沉积，可导致肺血管壁变厚、管腔狭窄顺应性降低是导致肺血管重构的基础，低氧肺血管重构的机制目前尚未完全阐明[1,2]。二苯乙烯苷(2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-o-glucoside，TSG)是从中药何首乌分离的一种主要有效活性成分单体，研究表明TSG可通过调节NO、血管内皮生长因子、MMP-2/9等的表达，抑制血管的内膜增厚及脂质沉积[3,4]。研究还发现，TSG通过调节ERK1/2和NO/cGMP/PKG信号通路，抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖，起到抑制动脉粥样硬化的作[5,6]。有关TSG在低氧PASMCs增殖中的作用及其机制未见相关研究。本研究通过观察低氧条件下TSG对大鼠PASMCs增殖影响，从细胞水平探讨TSG对低氧肺血管重构的影响及其机制。
材料与方法
1.材料：SD大鼠(150～200g)购自武汉大学实验动物中心；Ⅰ胶原酶、溴化乙锭(PI)、RNA酶、DCFH-DA购自Sigma公司； CCK-8试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；DMEM/F12培养基、0.25%胰酶、双抗(青霉素+链霉素)、胎牛血清等购自Hyclone公司； HIF-α抗体以及GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司。低氧培养箱购自Coylab公司，荧光酶标仪购自Bio-Tek公司。
2.SD大鼠PASMCs原代培养：采用0.2% Ⅰ胶原酶消化分离PASMCs，细胞传至第3代时经SM-α-actin免疫细胞化学染色法进行血管平滑肌细胞鉴定(纯度>95%)，使用0.25%的胰酶消化PASMCs并以1∶2的比例传代，4～10代细胞生长稳定用于本研究。
3.实验分组：①空白对照组;②低氧组;③10μmol/L TSG低氧组;④20μmol/L TSG低氧组;⑤50μmol/L TSG低氧组。常氧组采用95%空气+5%CO2培养，低氧培养采用低氧培养采用 3%O2、92%N2和 5%CO2培养，当细胞融合度达到70%左右时，采用不含血清的培养基饥饿细胞24h，完全排除血清的影响后，分别进行常氧或低氧培养，其中TSG干预组给予不同浓度的TSG预处理2 h后进行低氧培养。
4.PCR检测HIF-1α：细胞生长于6孔板，冷PBS洗涤两次，每孔加入1ml TRIzol提取细胞的总RNA，采用紫外分光光度法测定其含量与纯度。 取大约5μl总RNA，使用罗氏反转录试剂盒反转录为cDNA。PCR扩增后采用GAPDH比较得出标准化值。引物序列为：GAPDH：上游引物：5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下游引物：5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′；HIF-1α：上游引物：5′-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3′，下游引物：5′-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3′。
5.CCK-8检测细胞增殖及细胞毒作用：将细胞接种至96孔板中，各组低氧或常氧培养24h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育3h，测定450nm吸光度。
6.细胞周期检测：细胞接种至6孔板中，各组低氧或常氧培养24h后，胰酶消化并收集细胞，70%乙醇(无水乙醇+PBS)于4℃固定过夜。1500r/min离心5min，1ml的PBS洗细胞2次， 加入485μl PBS重悬细胞、Triton X-100 1μl、1mg/ml RNase 5μl、 1mg/ml溴化乙锭(PI)10μl，4℃避光孵育30min后，通过流式细胞仪分析细胞周期。
7.ROS的检测：将细胞以100μl，5×103/孔均匀接种于96孔板中，置于培养箱培养，细胞融合度达到70%时，将培养基更换为无血清的培养基饥饿24h，然后采用不同处理因素干预24h，将96孔板中的培养基换为用无血清培养液稀释终浓度为10μmol/L DCFH-DA，继续孵育20min之后将培养基吸出，使用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以排除未进入细胞内部的DCFH-DA的影响，最后再次加入磷酸盐缓冲液(PBS)100μl，置于酶标仪下检测，激发光波长为485nm，发射光波长为525nm。
结 果
1.TSG能够抑制低氧PASMCs增殖：低氧刺激24h能够促进PASMCs增殖 (P<0.05)，TSG(10、20、50μmol/L)抑制低氧诱导的PASMCs增殖具有浓度依赖性(P<0.05，图1)。
图1 TSG对低氧PASMCs增殖的影响(n=6)与对照组比较，#P<0.05，与0μmol/L二苯乙烯苷+低氧组比较，*P<0.05
2.TSG对PASMCs存活率无影响：结果显示，与对照组相比，3种药物浓度(10、20、50μmol/L)二苯乙烯苷干预24h对PASMCs的存活率差异无统计学意义(P>0.05，图2)。
图2 TSG对PASMCs存活率的影响(n=6)
3.TSG可抑制PASMCs细胞周期于G0/G1期：低氧刺激PASMCs 24h后，处于G0/G1细胞比例减少，S期细胞比例增加，G2/M期细胞比例增加。与0μmol/L二苯乙烯苷+低氧组相比TSG(10、20、50μmol/L)可使G0/G1细胞比例增加，S期细胞比例增加(P<0.05)，对G2/M期细胞比例无明显影响(P>0.05)。结果表明TSG可阻滞PASMCs细胞周期于G0/G1(图3)。
图3 TSG对PASMCs细胞周期的影响(n=6)
4.TSG可抑制HIF-1α mRNA的表达：与对照组相比，低氧刺激PASMCs 24 h后，PASMCs内HIF-1α mRNA的表达增加(P<0.05)。与0μmol/L二本乙烯苷+低氧组相比，TSG(10、20、50μmol/L)可抑制PASMCs内HIF-1α mRNA的表达，且具有浓度依赖性(P<0.05，图 4)。
图4 TSG对HIF-1αmRNA的表达的影响(n=6)与对照组比较，#P<0.05;与0μmol/L二苯乙烯苷+低氧组比较，*P<0.05
5.TSG可抑制ROS产生：与对照组相比，低氧刺激PASMCs 24h后，PASMCs内ROS增加(P<0.05)，与0μmol/L二苯乙烯苷+低氧组相比，TSG(10、20、50μmol/L)可抑制PASMCs内ROS产生，且具有浓度依赖性(P<0.05，图 5)。
图5 TSG对ROS产生的影响(n=6)与对照组比较，#P<0.05；与0μmol/L二苯乙烯苷+低氧组比较，*P<0.05
讨 论
本研究发现， TSG抑制低氧PASMCs增殖，并且实验浓度的TSG对PASMCs无明显毒性作用。本研究还表明TSG是通过阻滞细胞周期于G0/G1期抑制低氧PASMCs增殖。进一步的研究表明，TSG抑制PASMCs增殖的机制是通过降低细胞内HIF-1α表达及ROS产生来实现的。这些结果提示，TSG可抑制PASMCs增殖，继而低氧肺血管重构。
低氧能够使肺动脉壁各层细胞一系列结构和功能的变化，尤其是中膜层PASMCs的异常增殖在低氧肺血管重构中发挥关键作用[7,8]。细胞增殖受细胞周期的严格调控，正常生理情况下PASMC处于静止G0期，肺血管重构时需要处于静止G0期PASMCs进入和通过细胞周期各阶段[9]。本研究表明TSG可抑制PASMCs细胞周期于G0/G1期，从而抑制低氧PASMCs增殖。
HIF-1是低氧条件下广泛表达于哺乳动物和人体的一种转录因子，由一个由调节性亚基HIF-1α和一个构成性亚基HIF-1β组成，HIF-1α决定HIF-1的活性，HIF-1α常氧条件下会经泛素途径降解而丧失活性，低氧时HIF-1α表达上调，并进入细胞核与HIF-1β结合形成二聚体后调节相关靶基因的转录，是细胞适应低氧的核心调控因子，与低氧性肺动脉高压和肺动脉平滑肌细胞增殖关系密切[10]。HIF-1α可增加细胞内Ca2+浓度的以及调节多种活性介质的表达，进而刺激肺动脉平滑肌细胞增殖[11]。活性氧族(reactive oxygen species, ROS)是起源于线粒体呼吸链和电子传递链的反应分子和自由基，作为细胞内信号分子，参与细胞增殖及凋亡的调控。低氧条件下PASMCs内ROS产生增加，运用抗氧化剂清除ROS，可以抑制低氧PASMCs增殖[12]。研究表明ROS可能是通过调节HIF-1α表达及活性来调控低氧PASMCs增殖[12,13]。另外ROS还可以通过调控ERK1/2信号通路促进低氧PASMCs增殖[14]。本研究发现低氧能够促进PASMCs 内HIF-1α mRNA的表达及ROS产生，而TSG可抑制PASMCs内HIF-1α mRNA的表达及ROS产生。因此，推测TSG抑制低氧PASMCs增殖机制可能与抑制HIF-1α mRNA的表达及ROS产生有关。TSG有可能对低氧肺血管重构起到抑制作用。
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(修回日期：2015-02-26)
Effect of 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on the Proliferation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells Induced by Hypoxia.
ZhangZhiyong，YangShuizhen.
ZhongxiangPeople′sHospital,Hubei431900,China
Objective To investigate the effects of the 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on the proliferation of PASMCs induced by hypoxia, in orde to search new drugs for the treatment and prevention of hypoxic pulmonary vascular remodeling. Methods 3% O2hypoxia was used to induced the proliferation of PASMCs. After hypoxic and TSG treatment for 24h, cell growth was determined by cell counting kit-8 (CCK-8), cell cycle was analysed by flow cytometry, the mRNA expression of HIF-1α was measured by quantitative real-time PCR, and the reactive oxygen species (ROS) production was determined by the fluorescence microplate reader. Results TSG can block the proliferation of PASMCs through G0/G1to S phase of the cell cycle arrest without cell cytotoxicity. Further experiments showed that TSG blocking the proliferation of PASMCs was associated suppression the mRNA expression of HIF-1α and the production of intracellular ROS in hypoxia- stimulated-PASMCs. Conclusion TSG can inhibit the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells induced by hypoxia through suppression the mRNA expression of HIF-1α and the production of intracellular ROS.
Hypoxia; Pulmonary artery smooth muscle cells; 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside; Proliferation
431900 钟祥市人民医院耳鼻喉科(张志勇)，呼吸科(杨水珍)
张志勇，电子信箱：zhangzhiyong2014@163.com
R3
A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.043
2015-02-05)
