徐 莲 陆 雪 李 堂 戴润芝 江 洋

喉癌是头颈部发生率较高的一种恶性肿瘤,目前主要通过手术、放化疗和生物治疗等方式进行治疗,5年生存率有所提高,但是高复发率和转移率仍是预后面临的一个重要难题,因此深入研究喉癌发生、发展的具体机制具有重要意义[1]。去氢木香内酯是木香挥发油中含量较高的倍半萜内酯,也是木香具有药理学作用的主要生物活性成分,具有广泛的抗肿瘤活性。去氢木香内酯可抑制肝癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡[2]。此外,去氢木香内酯可使细胞内大量产生活性氧,诱导胃癌细胞自噬性死亡和凋亡[3]。但是,去氢木香内酯在喉癌中的作用需要进一步研究。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路是细胞内重要的信号转导通路,研究发现,PI3K/Akt信号通路在喉癌中异常激活,小檗碱通过抑制该信号通路可抑制喉癌细胞生长和转移[4]。长链非编码RNA SSTR5-AS1通过抑制PI3K/Akt信号通路活化抑制喉癌细胞增殖、迁移和侵袭[5]。但是去氢木香内酯是否能通过调节PI3K/Akt信号通路发挥抗喉癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用尚未可知,因此本研究探讨去氢木香内酯对喉癌恶性生物学行为的影响及其具体机制,为降低喉癌发生率和提高喉癌患者生存率提供新的研究思路和靶点。

材料与方法

1.细胞系:人喉癌Hep-2细胞购自美国ATCC公司。

2.试剂和仪器:去氢木香内酯(纯度≥98%,批号:A0302,成都曼思特生物科技有限公司);MTT试剂盒(批号:C0009,上海碧云天生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号:G003-1-2,南京建成生物工程研究所);DMEM培养基以及胰蛋白酶(批号:C11995500BT,25200-056,美国Gibco公司);p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog抗体(批号:ab278545、ab302958、ab38449、ab8805、ab92494、ab243894、ab109250,英国Abcam公司);CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司);Varioskan LUX多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司);DYCZ-24F双垂直电泳仪(北京六一仪器厂)。

3.细胞培养与转染:将Hep-2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃、5% CO2以及饱和湿度的培养箱中,每天更换1次培养基,每2天进行消化传代,取传至第4代的细胞用于实验。

4.MTT法检测细胞存活率:第4代对数生长期细胞经胰蛋白酶消化,离心后,调整为5×103个/毫升的细胞密度,将100μl细胞悬液加入96孔板,重新置于恒温培养箱中培养,细胞贴壁生长后,将细胞分为0、10、20和30μmol/L组,各孔分别加入含对应浓度的去氢木香内酯的培养基进行培养,分别在去氢木香内酯处理24、48和72h后,每孔加入MTT溶液10μl,重新培养4h,置于酶标仪下测量450nm波长处吸光度(A)值,细胞增殖抑制率(%)=(对照孔A值-药物孔A值)/对照孔A值×100%。

5.流式细胞仪检测细胞凋亡率:对数生长期细胞调整为5×103个/毫升的细胞密度,将100μl细胞悬液加入96孔板,细胞贴壁生长后,将细胞分为0、10、20和30μmol/L组,各孔分别加入含对应浓度的去氢木香内酯的培养基进行培养,24h后,胰蛋白酶消化收集细胞,加入磷酸盐缓冲液400μl,轻轻吹打,将细胞制成悬液,在向细胞悬液中加入Annexin-V 5μl,充分混匀,4℃避光孵育15min,再加入碘化丙啶 10μl,充分混匀,避光孵育5min,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

6.Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力:细胞侵袭能力检测:无血清培养基将基质胶稀释,并平铺于上室,将经不同浓度去氢木香内酯培养24h的细胞制成1×106个/毫升的细胞悬液,取200μl置于Transwell小室上室,在下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,之后将小室放置于培养箱中培养24h,湿棉签轻轻擦去未穿膜细胞,甲醛固定,0.1%结晶紫染色,显微镜下计数细胞数并拍照。细胞迁移能力检测:除Transwell小室上室不铺基质胶外,其余操作同细胞侵袭能力检测。

7.蛋白印迹法检测细胞中蛋白相对表达量:收集经不同浓度去氢木香内酯处理后的Hep-2细胞,预冷PBS清洗2次,裂解液冰上裂解30min,4℃ 12000r/min(离心半径8cm)离心10min,收集上清液,BCA法测定蛋白浓度,100℃煮沸。每孔上样20μl,设置电泳仪参数为120V 2h,蛋白分离后,将蛋白湿转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h,将PVDF膜裁开进行抗体孵育(4℃孵育过夜),二抗室温孵育,TBST洗膜,ECL显影液在成像系统中曝光,Image J分析条带灰度值,目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH灰度值。

结 果

1.MTT法检测:与0μmol/L组比较,10、20和30μmol/L去氢木香内酯分别作用24、48和72h后,细胞增殖抑制率均显着升高,且具有浓度和时间依赖性(P<0.05,表1)。

表1 各组细胞增殖抑制率比较

2.流式细胞仪检测侵袭能力:与0μmol/L组(2.97%±0.85%)比较,10、20和30μmol/L去氢木香内酯组(9.01%±0.62%、16.79%±1.35%、28.65%±1.31%)细胞凋亡率均显着升高,且有浓度依赖性(P<0.05,图1)。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡情况A.0μmol/L组;B.10μmol/L组; C.20μmol/L组; D.30μmol/L组

3.Transwell实验检测侵袭能力:与0μmol/L组(446.89±30.20个)比较,10、20和30μmol/L去氢木香内酯组(364.82±33.12、259.51±33.06、161.56±29.25个)侵袭细胞数减少,且具有浓度依赖性(P<0.05,图2)。

4.Transwell实验检测迁移能力:与0μmol/L组(491.31±41.89个)比较,10、20和30μmol/L去氢木香内酯组(432.66±45.36、358.02±35.92、158.05±24.23个)迁移细胞数减少,且有浓度依赖性(P<0.05,图3)。

5.蛋白印迹法检测:与0μmol/L组比较,10、20和30μmol/L去氢木香内酯组p-PI3K、p-Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相对表达量均降低(P<0.05),且有浓度依赖性。各组间PI3K和Akt蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05,表2,图4)。

图4 不同浓度去氢木香内酯对细胞中蛋白表达的影响A.0μmol/L组;B.10μmol/L组;C.20μmol/L组;D.30μmol/L组

表2 各组细胞中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相对表达量比较

讨 论

近年来,喉癌的发生率呈逐年上升趋势,但是,对于喉癌发生的具体机制尚不明确,普遍认为其与吸烟、饮酒、接触有害粉尘以及乳头状瘤病毒感染等多种因素有关,其发生和恶化进程是个复杂的转化过程,涉及多条信号通路的调控作用[6]。去氢木香内酯是从云木香的干燥根茎中提取的一种含有α-亚甲基-γ-内酯环结构的倍半萜类化合物,该结构能与含有巯基的酶及其功能性蛋白酶发生反应,进而干扰细胞的代谢过程,是具有多种药理学活性的化合物[7]。研究发现,去氢木香内酯通过抑制胃泌素瘤细胞增殖、阻滞细胞周期以及造成DNA损伤和线粒体膜电位降低,从而发挥抗胃泌素瘤作用[8]。去氢木香内酯通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,发挥抗乳头瘤作用[9]。马强等[10]研究发现,去氢木香内酯可抑制乳腺癌SK-BR-3细胞增殖,诱导其发生凋亡。由此可见去氢木香内酯具有广泛的抗肿瘤活性,因此,本研究旨在探讨去氢木香内酯是否具有抗喉癌作用及其具体机制。

肿瘤形成是一个十分复杂的生物学过程,其生长取决于细胞增殖和凋亡之间的平衡,抗肿瘤药物主要通过抑制肿瘤细胞增殖以及促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。本实验结果显示,不同浓度去氢木香内酯均可抑制喉癌Hep-2细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,且具有浓度依赖性。此结果说明,去氢木香内酯具有抗喉癌作用。癌细胞发生迁移和侵袭是肿瘤患者预后不良的重要原因,也是导致患者5年生存率降低的主要因素,因此阻断细胞发生迁移和侵袭对提高患者5年生存率至关重要。癌细胞发生迁移和侵袭是一个多步骤、多因素参与的复杂过程,研究发现,喉癌细胞具有较强的转移和侵袭能力[11]。本实验结果显示,不同浓度去氢木香内酯可降低Hep-2细胞迁移和侵袭数量,说明去氢木香内酯具有抑制喉癌迁移和侵袭的作用。

研究发现,PI3K/Akt信号通路活化在喉癌细胞转移和侵袭过程中发挥重要作用,miR-509-3p过表达通过抑制PI3K/Akt信号通路可抑制喉癌细胞增殖、迁移和侵袭[12]。长链非编码RNA SSTR5-AS1通过降低p-PI3K和p-Akt表达抑制喉癌细胞迁移和侵袭能力[13]。Li等[14]研究发现去氢木香内酯通过抑制PI3K和Akt活化从而抑制重组HPV-18 HaCaT细胞生长,诱导细胞凋亡,可能是一种新的治疗尖锐湿疣的潜在药物。

本研究中蛋白印迹法结果显示,不同浓度去氢木香内酯均可降低p-PI3K和p-Akt蛋白相对表达量,说明去氢木香内酯可抑制喉癌细胞中PI3K/Akt信号通路活化。癌症干细胞(cancer stem cells,CSCs)能够实现自我更新,而且产生异质性肿瘤,CSCs具有无限增殖能力,可以维持肿瘤细胞群的活力[13]。研究表明,长链非编码RNA PINT通过调控miR-425-5p/PTCH1轴抑制喉癌细胞干细胞特性从而抑制喉癌发生[14]。Sox-2、CD44、CD133和Nanog是干细胞特异性标志物[15]。因此本研究通过蛋白印迹法检测干细胞特异性标志物蛋白表达情况,结果显示,不同浓度去氢木香内酯可降低Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相对表达量,且具有浓度依赖性,说明去氢木香内酯可抑制喉癌干细胞特性,抑制癌细胞增殖。

综上所述,去氢木香内酯可抑制喉癌细胞增殖、迁移和侵袭,同时可抑制喉癌干细胞特性,其可能是通过阻碍PI3K/Akt信号通路活化发挥作用,为临床治疗喉癌提供理论依据。