小鼠前脂肪细胞3T3-L1培养与四联诱导分化方法的探讨

孙慧志，田德润△，孟洁，赵楠，韩洁，甘椿椿，王勇

小鼠前脂肪细胞3T3-L1培养与四联诱导分化方法的探讨

孙慧志1，田德润1△，孟洁2，赵楠2，韩洁1，甘椿椿3，王勇2

目的 改进小鼠前脂肪细胞3T3-L1的培养并诱导分化为成熟脂肪细胞的方法。方法 使用含有10%胎牛血清（FBS）的高糖型DMEM液体培养基常规培养小鼠前脂肪细胞，2～3 d换液1次。细胞按诱导分化方式的不同分为三联诱导组和四联诱导组。三联诱导组诱导分化培养基Ⅰ成分为常规培养基基础上加用人胰岛素10 mg/L，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（IBMX）0.5 mmol/L，地塞米松（DEX）1.0 μmol/L；四联诱导组诱导分化培养基Ⅰ的成分为在三联诱导组基础上加入吲哚美辛0.1 mmol/L。2组均诱导分化培养基Ⅰ培养2 d，连续诱导2次后换用诱导分化培养基Ⅱ，成分为：高糖型DMEM培养基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素混合液，人胰岛素10 mg/ L。培养2 d，连续诱导2次。倒置显微镜和油红O染色观察诱导前及诱导后2组细胞的形态变化。结果 小鼠前脂肪细胞3T3-L1状态良好，呈现铺路石状生长，均匀布满培养瓶底，2 d传代1次。四联诱导组诱导分化结果优于三联诱导组。三联诱导剂诱导前脂肪细胞后，细胞形态并未发生明显变化。四联诱导剂诱导前脂肪细胞后，可达到90%以上的成熟脂肪细胞。成熟的脂肪细胞呈圆形，有大量脂滴聚集，油红O染色显现橘红色。结论 在三联诱导基础上加入吲哚美辛的四联诱导法可以更好地促进脂肪前体细胞分化。

脂细胞；体外研究；细胞培养技术；3T3-L1细胞

随着经济的发展和生活方式的改变，低运动、高摄入、久坐等不良生活方式导致的肥胖已成为一个全球性的问题［1］。2010年我国成人超重率为29.3%，肥胖率为5.7%［2］。研究认为，肥胖症可以导致血脂异常、高血压、冠心病、糖尿病、呼吸睡眠暂停、骨关节炎、部分肿瘤（如乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌）等一系列并发症［3-4］，但具体发病机制尚不清楚。小鼠前脂肪细胞3T3-L1是首选的研究脂肪细胞分化的模型细胞，被广泛应用于肥胖的机制以及相关疾病的药物筛选研究［5］。目前，常用的培养和诱导分化脂肪细胞的方法多为三联诱导法，但该方法的诱导和分化效果并不理想。本研究旨在采用四联诱导法优化3T3-L1的培养和诱导分化，以期为肥胖药物开发和研究提供更好的模型。

1 材料与方法

1.1 主要材料 小鼠前脂肪细胞系3T3-L1由天津医科大学药学实验室段宏泉教授馈赠。高糖型 Dulbecco’5 modified Eagle’s medium（DMEM）液体培养基购自美国Invitrogen公司，牛血清（FBS）购自Hyclone公司；青霉素钠100 U/mL，硫酸链霉素100 mg/L，0.25%胰蛋白酶含0.53 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化液购自Bioroc公司，二甲基亚砜（DMSO）购自Amresco公司，油红O购自Solarbio公司；人胰岛素购自Biological Industries公司，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）及吲哚美辛购自Sigma公司。10%甲醛PBS（成分：分析纯甲醛10 mL、1×PBS缓冲液90 mL）购自天津市致远化学试剂有限公司。诱导分化培养基Ⅰ，成分：高糖型DMEM培养基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素混合液，人胰岛素10 mg/L，IBMX 0.5 mmol/L，DEX 1.0 μmol/L。诱导分化培养基Ⅱ，成分：高糖型DMEM培养基含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素混合液，人胰岛素10 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 小鼠前脂肪细胞3T3-L1置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基中培养。细胞贴壁生长，伸出伪足呈梭形，胞浆均匀细腻，无脂滴，细胞长至80%时进行传代。

1.2.2 细胞诱导分化 小鼠前脂肪细胞3T3-L1生长至完全汇合后开始计时，接触抑制2 d即诱导分化0 d开始，细胞按诱导分化方式的不同分为2组。（1）三联诱导组。诱导分化0 d起加入诱导分化培养基Ⅰ，2 d后更换新的诱导分化培养基Ⅰ，继续培养2 d后换成诱导分化培养基Ⅱ，2 d后更换新的诱导分化培养基Ⅱ，继续培养2 d，完成诱导分化过程。（2）四联诱导组。原诱导分化培养基Ⅰ中加入吲哚美辛0.1 mmol/L，余诱导方法和步骤同三联诱导组。

1.2.3 结果观察 倒置显微镜观察诱导前及诱导后2组的细胞形态。油红O染色：染色前将饱和油红O原液按 3∶2（油红O∶蒸馏水）加入去离子水，混匀，配制工作液，室温放置5～10 min，过滤后使用。将诱导完成后的细胞弃去原培养基，4%多聚甲醛室温固定10 min，去离子水充分洗涤，60%异丙醇浸洗，取配制好的油红O工作液进行染色，室温放置10 min，去离子水冲洗多余的油红O染料，Mayer苏木素复染细胞核，去离子水冲洗后显微镜下观察。前脂肪细胞诱导分化成为脂肪细胞后，使用油红O染色，可见油红O将脂滴染成红色。

2 结果

2.1 诱导分化前3T3-L1形态 倒置显微镜下可见小鼠前脂肪细胞3T3-L1呈梭形，传代后约2 h贴壁，4 h可伸出多伪足，呈片状生长，24 h长满细胞培养皿底面，呈铺路石样排列，可见细胞生长状态各不相同，部分处于分裂过程中，细胞生长状态良好，见图1。细胞铺满培养皿底面后会出现接触抑制现象，退出细胞周期，有丝分裂过程停止，此时前脂肪细胞进入向成熟脂肪细胞分化阶段，提示此时可以进行诱导剂的分化培养。

Fig.1 The appearance of mouse preadipocytes 3T3-L1 before being induced differentiation（×100）图1 诱导分化前小鼠前脂肪细胞3T3-L1形态（×100）

2.2 诱导分化后2组细胞形态学变化

2.2.1 三联诱导组 诱导分化前，前脂肪细胞3T3-L1呈梭形的成纤维细胞形态，细胞浆均匀细腻无脂滴；诱导完成时，前脂肪细胞3T3-L1胞浆内并未出现明显的小脂滴，细胞形态也并未发生明显变化，仍然呈梭形的成纤维细胞形态，见图2。

2.2.2 四联诱导组 诱导分化第4天即诱导分化培养基Ⅰ诱导完成时，细胞体积变大、变圆，胞质中出现散在细小脂滴；诱导分化第6天即使用人胰岛素诱导分化2 d后，细胞体积进一步增大、变圆，脂滴聚集明显增多，分布于细胞核周围，形成“戒环”样结构，在形态上转变为成熟脂肪细胞；诱导分化第8天时，细胞质中积聚更多的脂滴，90%以上细胞已分化成熟，见图3。

3 讨论

小鼠前脂肪细胞3T3-L1是1974年从Swiss 3T3-L1小鼠胚胎中分离克隆的细胞系，该细胞系具有单一分化潜能，体外培养时适当的诱导剂作用下可以分化为成熟脂肪细胞。脂肪细胞的分化是指胞浆均匀细腻不含脂滴的前体脂肪细胞定向分化为胞浆充满脂滴的成熟脂肪细胞的过程，其分化过程包括细胞有丝分裂停止、细胞形态增大变圆、脂类合成酶表达增加、脂质聚集以及增加胰岛素敏感性等生物学变化过程［6］。在前脂肪细胞向脂肪细胞转化的过程中，各种转录因子表达模式的转变发挥了重要作用，其中过氧化物增殖活化受体（Peroxisome proliferative activated receptor，PPARs）家 族 和CCAAT/增强子结合蛋白家族（CCAAT/enhance binding proteins，C/EBPs）转录因子的顺序激活开启了前脂肪细胞的分化过程，另外转录因子间的相互调控也促进了脂肪细胞的成熟［7］。脂肪细胞分化过程中的相关分子机制研究，为能量代谢及相关代谢疾病发生的分子机制和有效治疗提供了思路和方法。

本研究显示，小鼠前体脂肪细胞3T3-L1在分化过程中，细胞铺满培养皿底面后出现接触抑制，停止有丝分裂，退出细胞周期，提示此时可以进行诱导剂的分化培养。传统的脂肪细胞观察方法有2种，即倒置显微镜明场下直接观察脂肪空泡的出现和使用油红O将脂滴染成红色后再进行观察。本研究同时使用了2种方法验证脂肪细胞的出现，结果显示，使用三联诱导剂至诱导完成时，前脂肪细胞3T3-L1胞浆内并未出现明显的小脂滴，细胞形态也并未发生明显变化，仍然呈梭形的成纤维细胞形态。在四联诱导剂的刺激下，前体脂肪细胞再次进入细胞周期进入第二轮细胞分裂，随后调控分化的一系列转录因子相继表达，长梭形细胞转变为圆球形，细胞体积增大，胞浆内出现大量脂滴，分布于细胞核周围，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐由小变大，并融合形成“戒环”样结构，最后细胞进入脂滴永久性累积的终端分化状态。细胞形态的改变与文献［8］报道一致。与以往脂肪前体细胞诱导方法［9］不同，以往的方法中3T3-L1细胞体外成脂需10 d，本研究诱导分化培养基Ⅰ加入吲哚美辛0.1 mmol/L，可以在更短的时间内将前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞，并达到90%以上的诱导成功率。吲哚美辛属于非甾体类抗炎药。研究显示，部分非甾体类药物具有激活PPARγ的活性［10］。PPARγ是调控脂肪细胞分化主要核受体，主要存在于脂肪细胞中，是脂肪细胞分化的重要调控因子，并与胰岛素增敏存在密切关系。吲哚美辛是PPARγ的配体，能够活化PPARγ，从而发挥成脂诱导作用［11］。因此，结合本研究结果，笔者认为加入吲哚美辛可以更好地促进脂肪前体细胞分化。

综上所述，随着体外细胞培养模型的改建与相关研究的不断深入，小鼠前脂肪细胞3T3-L1的成功培养和更好的诱导分化是后续相关研究的基本前提。本研究为肥胖相关疾病的药物开发和研究，小鼠前脂肪细胞3T3-L1的培养及诱导分化提供了可靠的参考方法。

（图2、3见插页）

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（2016-03-26收稿 2016-05-24修回）

（本文编辑 陆荣展）

Discussion on cultivation and methodology of four-drug combination-induced differentiation in mouse preadipocytes 3T3-L1 cells

SUN Huizhi1，TIAN Derun1△，MENG Jie2，ZHAO Nan2，HAN Jie1，GAN Chunchun3，WANG Yong2
1 Department of Anatomy and Histology and Embryology，2 Department of Pathology，3 Department of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

Objective To optimize and establish the methodology for culturing and inducing differentiation of mouse preadipocytes 3T3-L1.Methods The mouse cells 3T3-L1 were incubated in DMEM medium contained with 10%FBS，during which the incubation medium was refreshed every 2 to 3 days.Two methods were used to introduce differentiation，including three-drug combination group and four-drug combination group.The protocol of mediumⅠin three-drug combination group including insulin 10 mg/L，IBMX 0.5 mmol/L and DEX 1.0 μmol/L.The protocol of mediumⅠin fourdrug combination group including indometacin 0.1 mmol/L based on those of three-drug combination group.Both of them were incubated for 2 days and continuous for 2 times.And mediumⅡincluded insulin 10 mg/L for 2-day culturing and continuous for 2 times.Oil red O staining was used to observe the morphological changes of two groups of cells before and after treatment under inverted microscope.Results Mouse preadipocytes 3T3-L1 appeared in good conditions and grew in a paving stone fashion.These cells covered homogeneously the bottom of incubators，the culture medium refreshed every 2 days.The results of four-drug combination group were better than those of three-drug combination group.After three-drug combination induced differentiation，there was no significant change in cell morphology.Comparing with three-drug combination induced differentiation，four-drug combination was successfully achieved in over 90%of the cell inducing，which were round-shaped，with jacinth ester droplets by oil-red O staining.Conclusion We have optimized the method for culturing and inducing differentiation of mouse preadipocytes 3T3-L1 by adding indometacin on the basis of the three-drug combination induced differentiation.

adipocytes；in vitro；cell culture techniques；3T3-L1 cells

R329.24

A

10.11958/20160214

1国家自然科学基金项目（81270927）；2天津医科大学基础医学院大学生科研基金

1天津医科大学人体解剖与组织胚胎学系（邮编300070），2病理教研室，3药学院

孙慧志（1998），女，临床七年制在读，主要从事肥胖发生机制的研究

△通讯作者 E-mail：tianderun@aliyun.com