王维，黄敬孚，林书祥，司萍，李胜英，祝益民，杨洪江
流行病学调查
天津地区儿童急性呼吸道和消化道感染Saffold病毒的检出和临床流行特征
王维1，黄敬孚1，林书祥1，司萍1，李胜英1，祝益民2，杨洪江3
目的调查天津地区儿童急性呼吸道和消化道感染中是否存在Saffold病毒（SAFV）感染及其流行病学特征。方法收集360份急性呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物和384份消化道感染患儿粪便标本，以针对SAFV 5′-UTR基因序列设计的特异性引物进行荧光定量PCR扩增，随机取阳性扩增产物进行核苷酸序列测定，并将所测序列在GenBank中进行比对。计算呼吸道和消化道SAFV感染阳性者的阳性率，不同年龄段及季节的SAFV阳性构成比和阳性检出率。同时考察SAFV与其他病毒的混合感染情况。结果呼吸道和消化道检测SAFV阳性率分别为11.9%（43/360）和16.4%（63/384）。不同性别的呼吸道SAFV阳性检出率差异无统计学意义［男、女分别为11.5%（28/243）和12.8%（15/117），χ2=0.13，P＞0.05］，年龄6 d～12岁，＜1岁者占79.0%（34/43）；消化道检测SAFV阳性患儿阳性检出率差异有统计学意义［男、女分别为13.4%（33/246）和21.7%（30/138），χ2=4.47，P＜0.05］，年龄5 h～11岁。不同年龄段的呼吸道和消化道SAFV阳性检出率差异均无统计学意义。不同季节呼吸道SAFV阳性检出率差异有统计学意义，以冬季和夏季为主（P＜0.01），而消化道SAFV阳性检出率差异无统计学意义。呼吸道和消化道SAFV与其他病毒混合感染率分别为7.0%（3/43）和12.7%（8/63）。结论天津地区儿童存在SAFV感染，在急性呼吸道和消化道感染患儿中具有较高的阳性检出率，且在1岁以内患儿中的阳性检出率较高，应该引起临床重视。
呼吸道感染；胃肠道；流行病学研究；天津；Saffold心肌炎病毒；儿童
Saffold病毒（SAFV）RNA为微小RNA，属于无包膜的正链单股RNA。心病毒属、肠道病毒属、肝炎病毒属、小RNA病毒属、鼻病毒属、口蹄疫病毒属等均为微小RNA［1-2］。SAFV为1981年从发热婴儿的粪便中分离出的一种新病毒，但直到2007年病毒基因序列扩增研究证实，SAFV是除Vilyuisk人脑脊髓炎病毒（VHEV）外，心病毒属中第2个可以感染人类的病毒［3］。在急性非脊髓灰质炎性弛缓性麻痹综合征（AFP）患儿、呼吸道或消化道感染患儿的鼻咽分泌物和粪便中，无菌性脑膜炎患儿的脑脊液标本中均可检测出SAFV，该病毒普遍存在，呈全球性分布［4-9］。SAFV在临床上常可引起急性胃肠炎、呼吸道及中枢神经系统感染，而中枢神经系统感染可致重症脑炎［1］。SAFV与呼吸道疾病［4-6］、消化道疾病［4-8］、神经系统疾病［4，6，9］、1型糖尿病［9］之间的关系为近年来研究的热点。本研究旨在通过对天津地区儿童呼吸道和消化道SAFV感染的临床流行病学特征进行初步分析，探讨其与儿童呼吸道和消化道感染的关系。
1 对象与方法
1.1研究对象360份鼻咽抽吸物（NPA）标本来自2013年1月—12月天津市儿童医院收治的有明显急性呼吸道感染症状的患儿，男243例（67.5%），女117例（32.5%），年龄40 h～14岁，其中≤1个月者80例（22.2%），2～6个月者117例（32.5%），7～12个月者111例（30.8%），1～3岁者36例（10.0%），4～7岁者13例（3.6%），＞7岁者3例（0.8%）。384份粪便标本来自同期消化道感染患儿，患儿大便呈稀水样、蛋花样或稀糊样，次数较平时增多，伴或不伴发热，呕吐；男246例（64.1%），女138例（35.9%），年龄5 h～13岁，其中≤1个月者71例（18.5%），2～6个月者78例（20.3%），7～12个月者176例（45.8%），1～3岁者32例（8.3%），4～7岁者19例（4.9%），＞7岁者8例（2.1%）。
1.2标本收集与处理急性呼吸道感染患儿入院后用一次性吸痰管吸取患儿鼻咽分泌物1～2 mL，置于含有6～8 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）的离心管中充分混合。样本悬液于2 000 r/min离心10 min，收集细胞做细胞涂片，采用直接免疫荧光测定法检测7种常见的呼吸道病毒：流感病毒A、B型（IFV A、IFV B），腺病毒（ADV），合胞病毒（RSV），副流感病毒1、2、3型（PIV1、PIV2、PIV3）。试剂盒为D3Ultra DFA RespiratoryVirusScreening&IDKit（DIAGNOSTICHYBRIDS，Inc. USA）。剩余标本立即于-70℃保存，供后续病毒检测使用。
消化道感染患儿粪便标本分装前，采用金标法检测轮状病毒（RtV）、ADV（RtV、ADV抗原检测试剂盒购自艾博生物医药杭州有限公司），酶标法检测星状病毒（AtV，德国拜发公司）。同一份样本分装2管，每管约1 mL。标本检测前编号并置于-70℃保存。
1.3Real-time PCR检测SAFV标本室温解冻后用Trizol（Invitrogen）提取病毒RNA，用随机六聚体引物逆转录合成cDNA（Quant cDNA第一链合成试剂盒，天根生化科技北京有限公司），保存于-20℃备用。操作过程严格按照说明书进行。运用Real-time PCR法对SAFV保守区5′-UTR片段进行扩增，引物序列SAFV（5′→3′）：上游TGGCGTGGTTG⁃GAATTAACATC（293～314 bp）；下游GGGCAGAAAACATCA⁃CATAATCG（345～367 bp）；SAFV-P探针：TTTCCGAC⁃GAAAGTGCTATCATGCCTCC（316～343 bp）。试剂盒采用天根SuperReal Premix（Probe）荧光定量预混试剂（探针法），目的片段大小约70 bp。每次PCR反应均设立阴性和阳性对照。SAFV阳性参考毒株由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所李利利教授惠赠。Ct值≤35.0且曲线有明显的指数增长期判断为检测样本阳性。随机取阳性样本的Realtime PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，将扩增产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序，并在GenBank上比对。
1.4其他病毒检测运用PCR及Real-time PCR方法，对360份鼻咽抽吸物标本检测鼻病毒［10］、多瘤病毒WU［11］、多瘤病毒KI［12］；对384份粪便标本检测人博卡病毒（HBoV）［13］、脑心肌炎病毒（EMCV）［14］、诺如病毒（NOV）［15］、肠道病毒（EV）［13］、Aichi病毒［13］及双埃可病毒（HPeV）［13］。
1.5结果判断计算呼吸道和消化道SAFV感染的阳性率，不同年龄段及季节的SAFV阳性构成比和阳性检出率。阳性率=阳性例数/总样本数×100%，阳性构成比=每组阳性例数/总阳性例数×100%，阳性检出率=每组阳性例数/每组的样本总数×100%。
1.6统计学方法采用SPSS 17.0统计学软件。符合正态分布的计量资料用表示。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1SAFV检测结果呼吸道和消化道检测SAFV阳性率分别为11.9%（43/360）和16.4%（63/384）。扩增出来的产物电泳显示，SAFV阳性标本在70 bp出现单一清晰条带，与预期结果相符，见图1。测序结果在GenBank上比对证实为SAFV。
2.2SAFV感染患儿的性别和年龄分布不同性别的呼吸道SAFV阳性检出率差异无统计学意义［男、女分别为11.5%（28/243）和12.8%（15/117），χ2= 0.13，P＞0.05］，阳性患儿年龄6 d～12岁，1岁内占79.0%（34/43）；不同性别的消化道SAFV阳性检出率差异有统计学意义［男、女分别为13.4（33/246）和21.7%（30/138），χ2=4.47，P＜0.05］，阳性患儿年龄5 h～11岁。不同年龄段的呼吸道和消化道SAFV阳性检出率差异均无统计学意义，见表1。
Fig.1SAFV detection in electrophoresis图1 SAFV检测结果
Tab.1Viral positive constituent ratio and positive detection rate in different age groups表1 不同年龄段患儿SAFV阳性情况
2.3SAFV感染的季节分布及不同部位的感染情况不同季节呼吸道SAFV阳性检出率差异有统计学意义，且以冬季和夏季为主（P＜0.01），而消化道SAFV阳性检出率差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。
2.4SAFV感染临床分析呼吸道43例SAFV阳性患儿中原发病诊断为支气管肺炎39例（包括新生儿肺炎3例），支气管哮喘2例，急性化脓性扁桃腺炎2例；其中同时伴有腹泻3例、粒细胞减少症5例、贫血6例、泌尿系感染2例、新生儿化脓性脑膜炎2例、新生儿败血症1例。
消化道63例SAFV阳性患儿的原发病均为腹泻，其中伴有呼吸道感染48例（包括上呼吸道感染11例，支气管肺炎37例，后者中新生儿肺炎7例），病毒性脑炎6例、癫痫5例（其中婴儿痉挛2例）、病毒性皮疹7例、轻度脱水2例、粒细胞减少症11例、贫血4例、鼻炎2例及泌尿系感染3例。
2.5混合感染呼吸道共检出PIV1 2例、PIV3 13例、IFV A 1例、RSV 28例、ADV 1例、鼻病毒6例、多瘤病毒KI 18例。消化道共检出RtV 26例、AtV 8例、ADV 7例、HBoV 5例、EMCV 6例、NOV 15例、EV 8例，Aichi病毒3例，HPeV 11例。SAFV与其他病毒存在混合感染的情况：呼吸道SAFV阳性样本中混合感染RSV 2例、PIV3 1例，混合感染率7.0%（3/43）。消化道SAFV阳性样本中混合感染EMCV 2例、NOV 4例、HPeV 2例，混合感染率12.7%（8/63）。
Tab.2Seasonal distribution of SAFV infection表2 SAFV检出的季节分布
3 讨论
本研究在鼻咽抽吸物标本中共检出43例SAFV阳性，阳性率为11.9%，高于日本2008年（2.1%）［16］、北京2007—2009年（0.5%）［17］、香港2013—2014年（未有检出）［18］的研究结果，与长沙2007—2008年（10.4%）［19］的研究结果近似。消化道共检出63例SAFV阳性，阳性率为16.4%，高于北京2006—2007年（3.2%）［20］、泰国2007年（2.7%）［21］、兰州2006—2008年（0.5%）［5］、上海2008—2010年（1.1%）［22］、丹麦2009—2011年（2.8%）［23］、日本2010—2011年（1.5%）［24］的研究结果。德国和巴西的相关研究显示胃肠炎患儿的粪便中SAFV阳性检出率分别为7.8%（4/51）和1.1%（2/188）［7］。巴基斯坦和阿富汗的相关研究显示患有急性迟缓性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）患儿的943份粪便中，可以检测到88例SAFV阳性，阳性率为9.3%［25］。截至目前，关于呼吸道和消化道标本SAFV阳性检出情况的报道多在2011年前，关于近两年SAFV与儿童急性呼吸道和消化道感染关系的研究较少，因此，结合本研究结果，笔者认为该病毒在国内的流行可能有增加的趋势。
通过对欧洲、非洲和亚洲等国家的人群进行血清学研究发现，在＞24个月的大龄儿童及成人中SAFV血清抗体的阳性率可高达90%［8］。另有研究亦认为，SAFV感染多见于6岁以下儿童［1，6-7］。因此，可以推测该病毒感染可能多发生在小儿早期。本研究数据显示，呼吸道阳性患儿年龄最小可至1个月，最大12岁，且1岁以下感染患儿占全部阳性患儿的79%，与日本［16］、北京［17］的研究结果近似。消化道SAFV阳性感染患儿年龄主要集中在3岁以内，也与多地相关报道一致［5-6，20］。
多地研究关于SAFV感染的高峰季节的报道不一。在对呼吸道标本的检测中，日本［16］、北京［17］均未发现明显的SAFV感染季节差异，长沙地区［19］的感染高峰主要集中于4、5月份。本研究显示，呼吸道SAFV感染高峰为夏、冬季；消化道SAFV感染一年四季均可发生。另有研究显示，北京SAFV阳性患儿均为2007年11月的住院患儿［20］；兰州4例SAFV阳性标本分别为6月1例，9月1例，10月2例，没有明显规律［5］。因此，笔者认为，SAFV感染在不同地区的季节差异可能与不同国家、不同地域的地理环境和气候有关，但确切的情况还需要长时间、大样本的监测。
通常情况下，SAFV可与多种病毒存在混合感染，且存在较高的合并感染率。呼吸道标本中，北京［17］7例阳性标本中有3例分别混合感染肺炎支原体（MP）、RSV和EV，混合感染率为42.9%；长沙［19］检测阳性患儿中合并其他病毒感染的有47例，占感染患儿的70.2%（47/67）。粪便标本中，北京［20］12例阳性标本中有5例混合感染NOV，7例混合感染RtV，混合感染率为11/12；泰国［21］和兰州［5］的阳性标本全部存在与其他病毒（HPeV、NOV、RtV）的混合感染；上海［22］有6例阳性标本，其中有3例存在与NOV或RtV的混合感染；日本［24］也有4/7的阳性标本存在与NOV、RtV或HBoV的混合感染。本文检出的7.0%（呼吸道）和12.7%（消化道）的合并感染率略低于以上报道，考虑这可能与各地区多种不同呼吸道和消化道病毒的流行情况有关。
综上所述，天津地区儿童存在SAFV感染，相对其他城市，在急性呼吸道和消化道感染患儿中具有较高的检出率，且在1岁以内患儿的阳性构成比较高，应该引起临床重视。本研究有助于完善本地区儿童急性呼吸道和消化道的病毒病原谱，但关于明确该病毒对儿童急性呼吸道和消化道疾病的关系及影响，还有待进一步深入研究。
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（2015-12-14收稿2016-04-22修回）
（本文编辑陆荣展）
Saffold virus detection and epidemiological characteristics in children with acute respiratory infection or digestive tract infection in Tianjin
WANG Wei1，HUANG Jingfu1，LIN Shuxiang1，SI Ping1，LI Shengying1，ZHU Yimin2，YANG Hongjiang3
1 Pediatric Research Institute，Tianjin Children's Hospital，Tianjin 300134，China；2 Emergency Center，Hunan Children's Hospital；3 College of Life Science，Tianjin University of Science&Technology
ObjectiveTo investigate prevalence and epidemiologic features of Saffold virus（SAFV）in hospitalized children with acute respiratory infection or digestive tract infection Tianjin area.MethodsNasopharyngeal aspirates from children with acute respiratory infection and fecal samples from children with digestive tract infection in Tianjin Children's Hospital were collected from January 2013 to December 2013.Viral nucleic acid was extracted，and SAFV infection was determined by using real-time quantitative PCR.Positive PCR products were sequenced.The sequencing results were aligned with known gene sequences of SAFV sequences in GenBank.The positive viral infection rate of nasopharyngeal aspirates and fecal samples，viral positive constituent ratio and positive detection rate in different age groups，seasonal distribution of SAFV infection were calculated. Other common respiratory tract or digestive tract viruses were also detected.ResultsFourty-three（11.9%）nasopharyngeal aspirates from children with acute respiratory infection tested positive for SAFV.There was no significant difference between male and female infected children（aged between 6 d and 12 years old）.The 79%（34/43）of the patients with SAFV infection aged under 1 year old.The infection most occurred in summer and winter.The 63（16.4%）fecal samples from children with digestive tract infection tested positive for SAFV.There was significant difference between male and female infected children（aged between 5 h and 11 years old）.SAFV infection was found to be year round.There was no significant difference in different age groups of nasopharyngeal aspirates and fecal samples.The mixed infection rate with SAFV and other respiratory tract or digestive tract viruses were 7.0%（3/43）and 12.7%（8/63），respectively.ConclusionInfection of SAFV had occurred in children with acute respiratory infection or digestive tract infection in Tianjin.SAFV has high detection rate in these children and is more common in childrenaged under 1 year old.The data suggest that some of acute respiratory infection or digestive tract infections in pediatric patients are related to SAFV.The Clinical doctors should pay attention to them.
respiratory tract infections；gastrointestinal tract；epidemiologic studies；TIANJIN；Saffold virus；children
R725.7，R181.32
A
10.11958/20150392
国家十二五科技支撑计划（2012BAI04B01）；国家自然科学基金项目（31370205）；天津市卫生局科技基金（2012KY11）
1天津市儿童医院，天津市儿科研究所（邮编300134）；2湖南省儿童医院急救中心；3天津科技大学生物工程学院
王维（1980），女，副研究员，主要从事儿童病毒感染相关研究
