miR-155通过调控PKG1影响滋养细胞生物学功能并参与子痫前期的机制探讨

岳巾晶　曾莹　郭晓佩　董越　姬若楠　彭瑞　罗晓华

摘要：目的 探究miR-155和环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶1（PKG1）在子痫前期患者胎盘组织中的表达及miR-155在核因子（NF）-κB的介导下通过抑制PKG1对滋养细胞HTR-8/SVneo功能的影响。方法 收集剖宫产分娩的正常产妇（NPE组）以及子痫前期产妇（PE组）的胎盘各20个，体外培养滋养细胞HTR-8/SVneo，分为NC组、mimics组、inhibitor组、siRNA NC组、PKG1 siRNA组、siRNA+inhibitor组；用NF-κB抑制剂PDTC处理细胞，分为Control组、PDTC组、PDTC+NC组、PDTC+mimics组。采用qPCR检测胎盘和滋养细胞HTR-8/SVneo中miR-155和PKG1 mRNA的表达；Western blot检测PKG1蛋白的表达；分别采用CCK-8法、Transwell法、流式细胞术检测细胞的增殖、迁移、凋亡能力。结果 PE组胎盘组织中miR-155的表达升高，而PKG1的表达降低（P＜0.05）。体外实验表明，与NC组相比，miR-155 mimics组中PKG1的表达降低，滋养细胞迁移、增殖能力减弱，凋亡能力增强，miR-155 inhibitor组中PKG1表达则升高，滋养细胞迁移、增殖能力增强，凋亡能力减弱（P＜0.05）；与Control组相比，PDTC组miR-155的表达降低，滋养细胞迁移、增殖能力增强，凋亡能力减弱（P＜0.05）。结论 miR-155在子痫前期中表达上调，并且可在NF-κB的介导下通过下调PKG1影响滋养细胞的增殖、迁移和凋亡。

关键词：先兆子痫；细胞运动；细胞增殖；细胞凋亡；NF-κB；miR-155；PKG1；滋养细胞

中图分类号：R714.244文献标志码：ADOI：10.11958/20221869

MiR-155 affects the biological functions of trophoblastic cells through regulating

cGMP-dependent kinase 1 and is involved in the mechanism of preeclampsia

YUE JinjingZENG Ying GUO Xiaopei DONG YueJI Ruonan PENG Rui LUO Xiaohua

1 Department of Gynaecology and Obstetrics， 2 Department of Scientific Research Office， the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450000， China

Corresponding Author E-mail： Luoxiaohua620@163.com

Abstract： Objective To investigate the expression levels of miR-155 and cGMP-dependent protein kinase 1 （PKG1） in placental tissue of patients with preeclampsia， and the effect of miR-155 on the function of trophoblasts HTR-8/SVneo by inhibiting PKG1 under the mediation of nucleus factor kappa B （NF-κB）. Methods Twenty placentas were collected from normal pregnant women and pre-eclampsia pregnant women who delivered by cesarean section. In vitro trophoblasts HTR-8/SVneo were cultured and  divided into the NC group， the  mimics group， the inhibitor group， the siRNA NC group， the PKG1 siRNA group and the siRNA+inhibitor group. Cells were treated with NF-κB inhibitor PDTC and divided into the control group， the PDTC group， the PDTC+NC group and the PDTC+mimics group. Real-time quantitative polymerase chain reaction （qPCR） was performed to detect the expression of miR-155 and PKG1 mRNA in placentas and HTR-8/SVneo cells. Western blot assay was performed to measure the level of PKG1 protein. The cell proliferation， migration and apoptosis were assessed by CCK-8 assay， Transwell assay and flow cytometry. Results The expression of miR-155 was significantly upregulated in placental tissue of the PE group， while the expression of PKG1 decreased significantly （P＜0.05）. The vitro experiments showed that compared with the NC group， the expression of PKG1 was significantly reduced in the miR-155 mimics group （P＜0.05）. The migration and proliferation ability of trophoblast was significantly weakened， the apoptotic ability was significantly enhanced （P＜0.05）. The expression of PKG1 was significantly increased in the miR-155 inhibitor group， the migration and proliferation ability of trophoblast was significantly enhanced， and the apoptotic ability was significantly weakened. Compared with the control group， the expression of miR-155 was significantly reduced in the PDTC group， the migration and proliferation ability of trophoblast was significantly enhanced， and the apoptotic ability was significantly weakened （P＜0.05）. Conclusion Results indicate that the expression of miR-155 is upregulated in preeclampsia， and can affect proliferation， migration and apoptosis of trophoblast cells by down-regulating PKG1 mediated by NF-κB.

Key words： pre-eclampsia; cell movement; cell proliferation; apoptosis; NF-kappa B; miR-155; PKG1; trophoblast

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的疾病，其特征是妊娠20周后出现蛋白尿和高血压。PE的发病率为2%～8%［1］，是导致孕产妇及新生儿死亡的主要原因之一，占全球孕产妇死亡的10%～15%［2］。目前普遍认为胎盘滋养层细胞侵袭异常、血管内皮功能受损与PE的发病密切有关［3］，但具体发病机制仍不清楚，缺少有效的治疗措施。微小RNA（microRNA，miR）是一类小分子非编码RNA，长度约22个核苷酸［4］。研究表明，miRNA的表达失调可能与PE的发生有关［5］。本团队前期研究发现，miR-155在子痫前期患者胎盘组织中高表达，并且可抑制滋养细胞的增殖、迁移、侵袭，促进其凋亡和炎性反应［6］。已有研究表明，miR-155可通过与一氧化氮（NO）/环磷酸鸟苷（cGMP）通路的主要下游分子环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶1（cGMP-dependent protein kinase 1，PKG1）的3′-非翻译区（UTR）互补结合，从而负向调节血管平滑肌细胞（VSMC）中PKG1的表达，进而导致VSMC表型转换和功能障碍［7］。然而，该通路在PE和滋养细胞中的作用尚未被证实，笔者推测miR-155可能通过调节PKG1参与PE的进展。本研究旨在探究miR-155/PKG1轴对PE的影响以及对滋养细胞生物学功能的调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2020年6月—2021年12月于郑州大学第三附属医院剖宫产分娩的PE产妇20例作为PE组，选择同期剖宫产分娩的正常产妇20例作为NPE组。PE的诊断标准参考《妊娠期高血压疾病诊治指南（2020）》［8］。2组产妇均排除双胎及多胎妊娠、慢性肝肾疾病、妊娠期糖尿病、传染性或代谢性疾病等。本研究经本院伦理委员会批准（伦理号：2022-238-01），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 人绒毛膜滋养层细胞HTR8/SVneo购自上海中国科学院细胞库；Trizol试剂购自日本TAKARA公司；Lipofectaimine 2000、Transwell小室购自美国Thermo Fisher Scientific公司；miR-155 mimic、inhibitor、NC、PKG1 siRNA以及PKG1 siRNA NC购自上海吉玛制药技术有限公司；PDTC购自英国Abcam公司；荧光定量PCR（qPCR）试剂盒购自德国DBI公司；PKG1抗体购自美国Boster公司；BCA蛋白定量试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PCR扩增仪（Mx3000P）购自杭州晶格科学仪器有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 标本的收集与处理 所有标本均在剖宫产胎盘娩出后5 min内收集，避开钙化灶及出血区域，于胎盘母面不同位置剪取胎盘组织，置于无菌的EP管中，并迅速置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 细胞分组转染 将体外培养的HTR-8/SVneo细胞分为6组：NC组（转染miR-155 NC）、mimics组（转染miR-155 mimic）、inhibitor组（转染miR-155 inhibitor）、siRNA NC组（转染PKG1 siRNA NC）、PKG1 siRNA组（转染PKG1 siRNA）、siRNA+inhibitor组（转染PKG1 siRNA和miR-155 inhibitor）。取对数期生长至密度为90%的细胞接种至6孔板（3?105/孔），并更换为无血清无双抗的培养基，按照Lipofectaimine 2000试剂盒说明书对各组细胞分别进行转染，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养4 h后更换为含10%胎牛血清的培养基继续培养48 h。

1.3.3 核因子（NF）-κB抑制剂PDTC处理 PDTC是国际公认的NF-κB抑制剂，可以在多种细胞中抑制NF-κB的激活。将细胞分为4组：Control组（常规培养）、PDTC组（PDTC处理）、PDTC+NC组（PDTC与miR-155 NC共处理）、PDTC+mimics组（PDTC与miR-155 mimics共处理）。PDTC组使用含PDTC 30 μmol/L的培养基培养48 h，PDTC+NC组与PDTC+mimics组中，miR-155 NC或miR-155 mimics转染后更换为含PDTC 30 μmol/L的培养基再培养48 h。

1.3.4 总RNA提取及qPCR检测 将所保存的胎盘组织从冰箱中取出，采用Trizol法进行胎盘组织和各组HTR-8/SVneo细胞中总RNA的提取，质检后继续-80 ℃保存。按照逆转录试剂盒说明书将RNA合成cDNA，随后用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪进行荧光定量， PCR反应条件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。miR-155以U6为内参，PKG1以GAPDH为内参。引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算miR-155和PKG1的相对表达量。

1.3.5 Western blot检测各组PKG1的表达 采用RIPA裂解液提取胎盘组织和各组HTR-8/SVneo细胞中的总蛋白，按照BCA试剂盒检测蛋白浓度，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，并转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗（1∶1 000）孵育过夜，然后加入二抗（1∶2 000）室温下孵育2 h，之后进行ECL显影，各条带的灰度值采用Image Pro Plus Ver.6.0进行分析，目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.6 Transwell检测细胞迁移能力 在Transwell小室的上室接种细胞（3?104/孔），下室加入含10%胎牛血清的完全培养基，培养24 h后采用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，随机抽取3张图片，显微镜下观察迁移细胞数。

1.3.7 CCK-8检测细胞增殖活性 将细胞接种于96孔培养板（3?103/孔）中培养12 h，分别于0 h、24 h、48 h、72 h时取出培养板，加入100 μL CCK-8工作液，再培养2 h，然后检测450 nm处的吸光度（A）值。

1.3.8 流式细胞术检测细胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书进行操作。首先收集培养48 h的细胞，制备细胞悬液，然后加入凋亡检测工作液，避光孵育15 min。用FlowJo软件测定细胞凋亡率。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0及Graphpad Prism 9.0软件进行数据分析。正态分布的计量资料以x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，2组间比较采用Mann-Whitney U检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者一般资料比较 与NPE组相比，PE组年龄、体质量指数（BMI）和孕周的差异无统计学意义（P＞0.05），收缩压（SBP）及舒张压（DBP）升高，而胎儿出生体质量降低（P＜0.05），见表2。

2.2 2组胎盘组织中miR-155及PKG1的表达比较 与NPE组相比，PE组miR-155的表达水平升高（P＜0.01），而PKG1的mRNA及蛋白［0.15（0.07，0.32） vs. 0.88（0.77，1.03），n=4，Z=16.000］水平均降低（P＜0.05），见表3、图1。

2.3 miR-155对滋养细胞HTR-8/SVneo中PKG1表达的影响 与NC组相比，miR-155 mimics组miR-155水平升高，miR-155 inhibitor组降低（P＜0.05），miR-155 inhibitor组PKG1 mRNA和蛋白水平升高，而miR-155 mimics组降低（P＜0.05）。见表4、图2。

2.4 miR-155对滋养细胞HTR-8/SVneo迁移、增殖、凋亡的影响 与NC组相比，miR-155 inhibitor组细胞迁移、增殖能力增强，细胞凋亡率减少（P＜0.05），而miR-155 mimics组细胞迁移、增殖能力减弱，细胞凋亡率增加（P＜0.05），见表5，图3、4。

2.5 抑制PKG1的表达后对miR-155、PKG1表达的影响 与NC组相比，inhibitor组miR-155水平降低，PKG1 mRNA和蛋白的水平升高（P＜0.05）；与PKG1 siRNA组相比，siRNA+inhibitor组miR-155水平降低，PKG1在mRNA和蛋白水平均升高（P＜0.05），见表6、图5。

2.6 抑制NF-κB的表达对滋养细胞HTR-8/SVneo中miR-155和PKG1水平的影响 与Control组相比，PDTC组miR-155水平降低，PKG1 mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与PDTC+NC组相比，PDTC+mimics组miR-155的水平升高（P＜0.05），PKG1 mRNA和蛋白水平均降低（P＜0.05），见表7、图6。

2.7 抑制NF-κB表达对滋养细胞HTR-8/SVneo生物学功能的影响 与Control组相比，PDTC组滋养细胞的迁移、增殖能力增强，凋亡率下降（P＜0.05）；与PDTC+NC组相比，PDTC+mimics组滋养细胞的迁移、增殖能力减弱，凋亡率增加（P＜0.01）。见表8，图7、8。

3 讨论

PE是一种严重威胁母婴健康的妊娠特异性疾病，伴有炎症反应和内皮细胞功能障碍［9］，如不及时治疗会导致脑卒中、肾功能衰竭、肺水肿、肝破裂、子痫等严重并发症［10］。目前PE的病因和发病机制尚不清楚，治疗旨在减缓病理进展以延长孕周，然而可用于治疗该疾病的临床策略有限，只有胎盘娩出才可彻底解除母体的症状，因而寻找有效的治疗靶点是当前围产医学领域中的研究热点。

3.1 miR-155在PE中的表达及作用 miRNAs在基因的表达调控中发挥着重要的作用，其通过与靶基因mRNA的3′-UTR反向互补，参与细胞分化、增殖、凋亡、代谢等多种生物学过程［11］。有学者研究miRNAs的基因表达谱发现，一些miRNAs，如miR-335、miR-424、miR-18a、miR-155可以通过作用于多种靶点导致滋养层细胞功能障碍［12-13］。miR-155是保守性较好的多功能miRNA之一，由位于21号染色体上的miR155宿主基因（MIR155HG）编码，可以在包括PE在内的多种疾病中表达。本课题组前期研究发现，miR-155在PE患者中高表达，并与其启动子区域DNA甲基化水平呈负相关［6］，但其具体机制尚不清楚。本研究通过对PE患者和正常产妇胎盘中相关因子的检测发现，PE患者胎盘组织中miR-155的表达水平显着升高，与Wu等［14］研究结果一致，而PKG1的表达明显降低，提示miR-155的高表达与PE的发生密切相关。

3.2 miR-155通过抑制PKG1的表达在PE中发挥作用 PKG1是cGMP的重要效应物，具有多种重要功能，如血管舒张与重建、细胞分化和凋亡等。NO/cGMP信号转导通路在内皮功能和心血管稳态中发挥重要作用［15］。NO由L-精氨酸通过内皮型一氧化氮合酶磷酸化形成，在调节血压方面起重要作用，NO可结合平滑肌细胞中NO的受体可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），从而将三磷酸鸟苷（GTP）转化为cGMP，引起cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）水平的升高而发挥生物学效应，当这一途径受损时可导致血管内皮功能受损、血管舒张障碍［16］。在哺乳动物中，PKG有2种同工酶，即PKG1和PKG2，由不同基因编码［17］。PKG1主要在心血管系统中发挥作用，而PE是一种以血管功能障碍为特征的疾病［18］，这表明在PE中PKG1可能更为重要。Choi等［7］研究认为，miR-155模拟物可降低VSMC细胞中PKG1的水平，从而导致VSMC表型发生改变和舒张功能障碍。为验证miR-155是否可通过抑制PKG1的表达进而影响滋养细胞的生物学功能，本研究采用滋养细胞HTR-8/SVneo进行了体外实验，转染miR-155 mimics或inhibitor建立过表达或干扰细胞模型，结果显示miR-155低表达可以上调滋养细胞PKG1 mRNA和蛋白的水平，还可增强细胞的增殖、迁移能力，诱导细胞凋亡，提示miR-155可通过抑制PKG1引起滋养层细胞的生物学功能发生改变。

3.3 抑制NF-κB表达后对PE的影响 NF-κB是一种细胞内转录因子，可以调节多种细胞功能，如炎症反应、胚胎发生、细胞增殖与凋亡以及对各种有害刺激的应激反应［19］。NF-κB信号转导通路是一种经典的促炎通路，在感染或损伤期间，组织会迅速释放促炎因子，如白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子α，从而激活NF-κB通路，进而促进炎性因子、趋化因子等的释放［20］。根据Staff［21］提出的改良PE两阶段模型，笔者认为PE的致病机制可能与氧化应激和炎症反应密切相关。在炎性因子的刺激下NF-κB通路被激活，促进机体进一步分泌大量的炎性细胞因子，持续存在的炎症反应可引发血管内皮损伤，从而促进PE的发展［22］。有研究表明，在PE大鼠体内选择性抑制NF-κB的表达可降低大鼠血压以及尿蛋白，并可减缓胎盘损伤［23］。Mann等［24］研究发现，炎症刺激可激活NF-κB，导致miR-155水平升高，进而抑制SHIP1和SOCS1以及其他潜在靶标的表达。本研究发现，与Control组相比，NF-κB抑制剂PDTC处理后滋养细胞miR-155表达降低，PKG1的表达则明显升高，滋养细胞的迁移、增殖能力明显增强，凋亡能力减弱，而转染miR-155模拟物后可逆转PTDC对PKG1水平以及滋养细胞生物学功能的影响。笔者推测NF-κB可能是通过miR-155发挥生物学作用，并影响PE进展的重要信号因子。

综上，PE患者胎盘组织中miR-155呈高表达，而PKG1呈低表达；NF-κB介导的miR-155通过下调PKG1的表达，从而抑制滋养细胞的增殖和迁移，增加细胞凋亡。本研究对miR-155在PE发病中的作用进行了初步分析，为明确PE的致病机制提供了新的理论基础。

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（2022-11-18收稿 2023-03-02修回）

（本文编辑 李鹏）