gAd对3T3-L1脂肪细胞肉碱酯酰转移酶-1表达的影响

孟海艳，廉 如，陈显久，王 彦

gAd对3T3-L1脂肪细胞肉碱酯酰转移酶-1表达的影响

孟海艳1，廉 如2，陈显久3，王 彦1

目的 探讨脂联素球状结构域(gAd)对3T3-L1脂肪细胞肉碱酯酰转移酶-1的影响。方法 用gAd蛋白干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，干预结束后用RT-PCR法检测各组细胞脂肪酸分解途径关键酶肉碱酯酰转移酶-I转录水平的变化，用Western blot法检测各组细胞肉碱酯酰转移酶-1翻译水平的变化。结果 与对照组相比，各实验组肉碱酯酰转移酶-1在转录和翻译水平的表达均显着增高(P<0.001)，且呈剂量依赖性。结论 gAd蛋白能够激活3T3-L1脂肪细胞内脂肪酸的分解途径，促进脂肪酸氧化。

脂联素球状结构域；3T3-L1脂肪细胞；肉碱酯酰转移酶-1

脂联素，又称为脂肪细胞补体相关蛋白30KDa(Acrp30)，于1995年由Scherer等[1]首次在小鼠3T3脂肪细胞中发现。人脂联素由247个氨基酸组成，包含4个结构域，球状结构域(gAd)为其活性域[2]。目前研究表明，脂联素可以通过激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路增加外周组织，包括骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取[3，4]，且已有研究报道了脂联素可以通过激活AMPK通路增加大鼠心肌细胞的脂肪酸氧化[5]，那么，脂联素对脂肪细胞脂肪酸的代谢有何影响呢？本研究拟用本课题组前期制备的gAd干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，探讨gAd对3T3-L1脂肪细胞内脂肪酸分解途径关键酶肉碱酯酰转移酶-1(carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 脂联素gAd，本课题组前期已成功制备[6]；3T3-L1前脂肪细胞株，山西医科大学第一医院内分泌科实验室冻存；DMEM/F12(1∶1)、高糖DMEM，GIBCO公司(美国)；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物有限公司；胰酶、二甲基亚砜(DMSO)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白(BSA)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，Sigma公司(美国)；考马斯亮蓝试剂盒，南京建成生物公司；Trizol试剂，Invitrogen公司(美国)；PCR引物，上海生物工程公司；cDNA反转录试剂盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)，Fermentas公司(美国)；PCR试剂盒(FastStart Universal SYBRGreen Mster)，Roche公司(美国)；抗CPT抗体，江苏希望生物科技有限公司。

1.2 实验方法 取本课题组前期制备的gAd蛋白，参照文献[6]的方法进行蛋白复性与浓度测定。取本实验室冻存的3T3-L1前脂肪细胞株，参考文献[7]的方法进行细胞培养分化和鉴定。

将诱导分化成熟后的3T3-L1脂肪细胞分别给予0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL、1 000 ng/mL的gAd蛋白干预，上述干预每组均设3个复孔，每孔加干预液4 mL，对照组加入等体积的生理盐水，5 h后结束干预。

[8]的方法进行常规总RNA的提取和常

规cDNA的合成。使用Primer引物设计软件设计脂肪酸分解代谢关键酶肉碱脂酰转移酶-1的PCR引物。参考文献[8]的方法进行RT-PCR操作、总蛋白的提取及Western blot操作。

2 结 果

2.1 gAd蛋白对3T3-L1脂肪细胞CPT-1转录水平表达的影响 CPT-1是细胞内脂肪酸β氧化的限速酶[9]。各组细胞CPT-1在转录水平表达差异有统计学意义(F=381.854，P=0.000)，其中与对照组相比，各实验组(gAd浓度分别为10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL、1 000 ng/mL)CPT-1在转录水平的表达均显着增高(P<0.01)，且高剂量gAd对其表达的上调作用均显着高于前一低剂量gAd(P<0.01)，详见表1。

表1 gAd对3T3-L1脂肪细胞CPT-I转录水平表达的影响(±s)

2.2 gAd蛋白对3T3-L1脂肪细胞CPT-1翻译水平表达的影响 进一步以Western blot法对CPT-1进行翻译水平检测结果显示，各组细胞CPT-1在翻译水平的表达差异有统计学意义(F=268.099，P=0.000)，与对照组相比，各实验组(gAd浓度分别为10 ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL)CPT-在翻译水平的表达均显着增高(P<0.01)，详见图1、表2。

注：1代表对照组；2 代表10 ng/mL gAd；3代表50 ng/mL gAd；4 代表100 ng/mL gAd；5代表300 ng/mL gAd；6代表1 000 ng/mL gAd。

图1 CPT-1翻译水平表达Wstern blot检测电泳图

表2 gAd对3T3-L1脂肪细胞CPT-1翻译水平表达的影响(±s)

3 讨 论

脂联素是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质，具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、抗炎症、保护心脏等重要的生物学活性[10-12]。gAd蛋白是脂联素的活性结构域，研究已证实，gAd蛋白可以通过激活AMPK通路促进大鼠心肌细胞脂肪酸氧化[5]。本研究以3T3-L1脂肪细胞为研究对象，研究结果显示，与对照组相比，各实验组脂肪酸β氧化的关键酶CPT-I在gAd蛋白干预后，其转录和翻译水平的表达均显着增高，且均表现出剂量依赖性(P<0.01)，提示gAd可激活3T3-L1脂肪细胞内脂肪酸的β氧化途径，促进脂肪酸的分解代谢。

参考文献：

[1] Scherer PE，Williams S，Fogliano M，et al.A novel serum protein similar to Clq，produced exclusively in adipocytes [J].J Biol Chem，1995，270(45)：26746-26749.

[2] Fruebis J，Tsao TS，Javorschi S，et al.Proteolytic cleavage product of 30-KD adipocyte complement-related protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weightloss [J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(4)：2005-2010.

[3] Almer G，Saba-Lepek M，Haj-Yahya S，et al.Globular domain of adiponectin promising target molecule for detection of atherosclerotic lesions[J].Biologics，2011，5：95-105.

[4] Wu X，Motoshima H，Mahadev K，et al.Involvement of AMP-activated protein kinase in glucose uptake stimulated by the globular domain of adiponectin in primary rat adipocytes [J].Diabetes，2003，52(6)：1355-1363.

[5] Li Li，Liling W，Cheng W，et al.Adiponectin modulates carnitine palmitoyltransferase-1 through AMPK signaling cascade in rat cardiomyocytes[J].Regulatory Peptides，2007，139：72-79.

[6] 黄敏，王彦，杨静.人脂联素球状结构域(gAd)的原核表达、纯化及生物活性检测[D].太原：山西医科大学，2010.

[7] Eunjin SHIN，Kyeong-Mi CHOI，Hwan-Soo YOO，et al.Inhibitory effects of coumarins from the stem barks of fraxinus rhynchophylla on adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells[J].Biol Pharm Bull，2010，33(9)：1610-1614.

[8] 萨姆布鲁克，拉塞尔.分子克隆实验指南[M].黄培堂，译.北京：科学出版社，2002：385-460；597-718.

[9] Muoio DM，Seefeld K，Witters LA，et al.AMP-activated kinase reciprocally regulates triacylglycerol synthesis and fatty acid oxidation in liver and muscle：Evidence that sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase is a novel target [J].Biochem，1999，338：783-791.

[10] Kern PA，di Gregorio GB，Lu T，et al.Adiponectin expression from human adipose tissue：Relation to obesity，insulin resistance，and tumor necrosis factor-expression[J].Diabetes，2003，52(7)：1779-1785.

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[12] Ohashi K，Ouchi N，Matsuzawa Y.Anti-inflammatory and anti-atherogenic properties of adiponectin[J].Biochimie，2010(94)：2137-2142.

(本文编辑 郭怀印)

1.山西医科大学第一医院(太原 030001)；2.内蒙古自治区鄂尔多斯市妇幼保健院；3.山西医科大学生物化学与分子生物学教研室

王彦，E-mail：wyroad@126.com

R329.2

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10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．008

1672-1349(2015)10-1175-02

2015-04-06)