王中琳，席加秋，付 强
·基础医学论着/研究·
复健片干预实验性脑梗死大鼠脑组织明胶酶的表达及对星形细胞胶质化的影响
王中琳1，席加秋2，付 强2
目的 观察高、中、低三种剂量复健片治疗实验性脑梗死大鼠过程中对脑组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属白酶-9(MMP-9)表达的变化，探讨复健片对星形细胞胶质化的影响。方法 用Tamura法对右侧近端大脑中动脉进行电凝术以制备MCAO大鼠模型。按随机法将45只大鼠分为中药组、模型组以及假手术组，中药组又因复健片灌胃剂量的不同，分为中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组，其他两组予等量的蒸馏水。以上各组均为9只。3组MCAO大鼠分别在给药1周、2周、4周时处死后取脑组织，用酶联免疫吸附法测定大鼠脑组织MMP-2、MMP-9的表达。结果 中药组治疗第2周和4周较1周比较，有统计学意义(P<0.05)，与模型组同期比较有统计学意义(P<0.05)，中药中剂量组较之同期高剂量组和低剂量组作用更为显着，尤其以第4周时最为明显。结论 复健片改善实验性脑梗死大鼠神经修复的内环境，激活其内修复机制，通过上调MMP-2、MMP-9的表达而抑制星形细胞过度胶质化，以促进神经功能的重塑，是复健片治疗脑梗死的作用机制之一。
脑梗死；复健片；大脑中动脉结扎； 基质金属蛋白酶-9
脑梗死后的脑功能恢复，至今仍是中西医临床和基础研究的重要课题。对于脑可塑性机制的研究，既往多注重通过调控神经生长因子和神经生长抑制因子的分子生物学机能状态以寻求脑功能改善[1]，但对于缺血损伤后继发胶质瘢痕影响脑重塑的研究则相对较少，尤其对于中医药干预星形细胞的过度胶质化，针对改善神经损伤修复环境的研究则更需要进一步加强。基于此，本课题对复健片能否调控明胶酶的表达从而影响胶质瘢痕的形成进行研究，中医药治疗脑血管疾病提供理论基础[2]。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选取45只健康清洁型雄性SD大鼠(统一由山东中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证：SCXK鲁20120001，为12周龄，体重300 g±20 g。检疫后备用，自由进水、摄食。
1.2 主要试剂 复健片由山东中医药大学药剂教研室提供，批号：20030115，由补益肝肾、祛风通络的药物组成，每片含生药2.25 g；戊巴比妥钠购买自上海化学试剂采购供应站；注射用青霉素钠购买自山东鲁抗医药股份有限公司；氯代三苯基四氮唑(红四氮唑，TTC)购自上海试剂三厂；基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)酶联免疫试剂盒购买自美国Bionewtrans Pharmaciutical Biotechnology Co..Ltd公司。
1.3 主要仪器 (见表1)
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 选取大鼠45只，随机分为假手术组、模型组(两组均分设7 d、14 d、28 d组) 和中药组(分为高、中、低3个剂量组，各剂量组又分设7 d、14 d、28 d组)。中药高、中、低剂量三组及其余两组大鼠样本均为9只。
表1 主要仪器
1.4.2 动物造模 模型组和中药组按Tamura[3]的方法对右侧近端大脑中动脉进行电凝术，制备实验性MCAO大鼠模型。若动物术后24 h内出现：①左侧肢体痛觉减退，痛刺激收缩现象消失；②行走时躯体向左侧倾倒或转圈；③提尾时左上肢不能向前伸直，同时具备这三项条件即可视为造模成功，将不符合条件者排除，剩余的大鼠模型即可纳入试验进行分组[4]。假手术组大鼠进行同样的开颅术，但不凝闭大脑中动脉，维持其血供状态，其余操作同模型组。
1.4.3 动物给药及脑组织取材 造模成功后中药组给予复健片灌胃，其中，高、中、低剂量组分别为12 g生药(1 g·d)、9 g、6 g生药/(kg·d)，模型组及假手术组分别给予等量蒸馏水30 mL/d灌胃，分别于给药7 d、14 d、28 d时断颈处死大鼠，开颅取梗死灶周围脑组织，并于-80 ℃冰箱中保存待测。
1.4.4 指标检测 (见图1)
图1 治疗检测步骤及结果判定标准
2 结 果
模型组大鼠明胶酶检测值在1周后同假手术组相比，有明显的提高。模型组1周、2周、4周后明胶酶的测值没有明显的变化。中药组分别在治疗1周、2周、4周同组间较1周时比较差异有统计学意义，提示随着治疗用药时间的延长MMP-2、MMP-9活性逐渐增强；中药组在治疗1周后MMP-2、MMP-9活性与同期模型组差异无统计学意义(P>0.05)，但在2周及4周表达显着增强(P<0.05)；中药组在治疗2周和4周较1周时比较差异有统计学意义(P<0.05)；中药中剂量组较同期的高剂量组和低剂量组作用更为显着(P<0.05)，在第4周时最为明显。详见表2。
表2 复健片对不同时相MCAO大鼠MMP-2、MMP-9表达的影响(±s) μg/mL
3 讨 论
缺血性卒中对神经系统的破坏，造成了神经轴突的损伤和脱髓鞘改变，并继发产生胶质瘢痕，这种主要由星形细胞过度增生形成的胶质瘢痕，可“屏障”阻止神经纤维的再生和向损伤区“靶的”的行进，从而影响神经功能的修复[5]。胶原作为瘢痕中阻碍轴突生长的主要成分可被胶原酶有效降解，其中Ⅳ型胶原酶发挥着主导作用，它的生物学活性类型主要有两种，即MMP-2 和 MMP-9[6]。本实验结果表明：运用补益肝肾中药复健片对MMP-2 和 MMP-9的活性进行有效调控，可为轴突的生长和髓鞘再生营造有利的重塑环境，从而对脑功能的恢复产生一定的积极影响。
有临床观察证实，复健片治疗脑梗死(中风病)安全有效。复健片为着名中医药专家王新陆教授所创制，由制首乌、决明子、槲寄生、海马、仙灵脾等药物组成，功专补益肝肾，兼以祛风通络。方中何首乌，古人认为“生用气寒性敛，有毒；制熟气温，无毒”(《本草汇言》)，结合现代药理研究，宜用其制者。本方以制首乌为君药，其味甘涩兼具温润之性，而有补肝益肾、颐养精血之功。又因其“为调和气血之圣药”(《本草分经》)，故治疗中风方中常用之。槲寄生味苦甘性平，“乃桑之精气所结”(《神农本草经百种录》)，功“助筋骨、益血脉”(《日华子本草》)。故亦善补益肝肾、强健筋骨，并具驱风通络之力，而常用为偏枯风痱诸证。决明子甘苦咸性凉，“益阴泄热，大补肝肾之气”(《本草经疏》)，“益肾水，清肝火”(《本草便读》)，故有调肝气清热明目，滋肾水润肠通便之能，有利人之气机畅和。二者共助首乌调补肝肾气血而为臣药。仙灵脾味甘而辛散温通，补助肾阳，祛风除湿，善“治一切冷风劳气，补腰膝，强心力……四肢不任，老人昏耄，中年健忘”(《日华子本草》)。复有性温味甘咸之海马，既善“暖水……消瘕块”(《本草纲目》)，又能“调气和血”(《品汇精要》)，以达温壮精血，通和经脉之功。诸药和合而用，是为中风肝肾亏虚证而设。
本试验设计不同剂量组，以探讨复健片影响MCAO大鼠星形细胞胶质化程度的量效关系，实验研究显示，灌胃2周后，中药中剂量组较同期的高剂量组和低剂量组作用更为显着，尤以第4周时最为明显。表明在进行相关的实验研究时必须要重视量效关系的合理设计。
复健片治疗脑梗死的作用机制之一：改善实验性脑梗死大鼠神经修复的内环境，激活其内修复机制，通过上调MMP-2、MMP-9的表达而抑制星形细胞过度胶质化，以促进神经功能的重塑。
[1] 黎彬如，龙佳佳.脑梗死后患者神经功能恢复不良的危险因素分析[J].中国实用神经疾病杂志，2015，18(8)：68-69.
[2] 韩萍，张娜，于春蕾，等.复健片干预神经-免疫系统治疗脑梗死的临床疗效[J].中国继续医学数育，2016，8(23)：188-190.
[3] Tamura A，Graham DI，Mc Culloch I， et al.Focal cerebral ischemia in the rat.Descreption of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion[J].J Cereb Blood Flow and Metab，1981，1：53.
[4] 胡怀强，王树才，等.复健片对大脑中动脉闭塞大鼠脑组织Rho/ROCK 的调控作用[J].中华中医药杂志，2014，29(4)：1218-1220.
[5] Sofroniew MV.Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation[J].Trends Neurosci，2009，32(12)：638-647.
[6] 李兵，易良，徐伦山，等.MMP1 MMP2 MMP9 与TIMP-1 TIMP-2 检测对脑胶质瘤的诊断作用分析[J].中国实用神经疾病杂志，2013，16(23)：4-6.
(本文编辑王雅洁)
Effects of Fujian Tablet on the Expression of Gelatinase to the Astrocyte in Rats with Experimental Cerebral Infarction
Wang Zhonglin，Xi Jiaqiu，Fu Qiang
The Affiliated Hosipital，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji’nan 250011，Shandong，China
Xi Jiaqiu (Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji'nan，Shandong，China)
Objective To observe the effect of high， medium and low doses of Fujian tablets (FJT) on the expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in brain tissue in rats with experimental cerebral infarction，and explore its effect on astrocytes. Methods The middle cerebral artery occlusion (MCAO) rat model was prepared by Tamura method in the right proximal middle cerebral artery. Forty-five rats were divided into FJT group (high dose FJT group， middle dose FJT group and low dose FJT group)， model group and sham operation group. Because of the different dosage of the Fujian tablet，the traditional Chinese medicine group was divided into the high dose group， middle dosegroup and low dose group， and the other two groups were given equal amount of distilled water. 9 rats in each group. The MCAO rats in three groups were sacrificed at 1 week， 2 weeks， 4 weeks.The expressions of MMP-9 and MMP-2 in brain tissue were detected by ELISA mothed.Results After 2 weeks and 4 weeks， There were significant differences in the expressions of MMP-9 and MMP-2 in brain tissue between FJT groups and model group (P<0.05).The expressions in middle dose FJT group were higher than that in high dose FJT group and low dose FJT group (P<0.05)， especially at fourth weeks.Conclusion FJT can up-regulated the expressions of MMP-2 and MMP-9，and inhibit the gliosis of astrocyte， promote the remodeling of neural function in in rats with experimental cerebral infarction.
cerebral infarction；Fujian tablet；middle cerebral artery occlusion；matrix metalloproteinase-9
山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2011HM010)
1.山东中医药大学附属医院(济南250011)；2.山东中医药大学
席加秋，E-mail：zydoctor7@126.com
信息：王中琳，席加秋，付强.复健片干预实验性脑梗死大鼠脑组织明胶酶的表达及对星形细胞胶质化的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(12)：1441-1444.
R743.3 R285.5
A
10.3969/j.issn.1672-1349.2017.12.006
1672-1349(2017)12-1441-04
2016-12-18)
