景 玮，马 彪，李 艳，李新毅
远志总皂苷对癫痫模型大鼠学习记忆及海马LTP的影响
景 玮1，马 彪2，李 艳3，李新毅1
目的观察远志总皂苷(TEN)对戊四氮(PTZ)点燃癫痫模型大鼠空间学习记忆能力及海马长时程增强(LTP)的影响。方法雄性Wister大鼠随机分为对照组、癫痫模型组、TEN组，利用水迷宫法观察各组大鼠的空间学习记忆能力，利用电生理学方法通过对高频刺激前后海马CA1区场兴奋性突触后电位(fEPSP)幅度比较检测大鼠海马LTP变化。结果与对照组相比较，癫痫模型组空间学习记忆能力显着下降，海马CA1区LTP受到显着抑制(Plt;0.05)；TEN可改善上述指标的异常变化(Plt;0.05)。结论TEN可改善癫痫模型大鼠空间学习记忆能力及海马LTP的抑制。
癫痫；学习记忆；远志总皂苷；海马；长时程增强
癫痫是一种常见的神经系统疾病，我国癫痫患病率高达0.7%[1]。有研究表明，癫痫病人常伴有学习记忆减退，注意力分散等认知功能障碍表现[2-3]。癫痫后认知功能损害的发病机制仍未阐明[4]，临床缺乏有效防治手段。远志是我国传统的安神益智良药，在提高学习记忆方面具有一定作用[5-6]，远志总皂苷(tenuigenin，TEN)是其有效成分[7-10]。本研究利用Morris水迷宫法[11]观察癫痫模型大鼠学习记忆能力，利用电生理方法记录在体大鼠海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)[12]变化，同时观察TEN对上述指标的影响，为临床新药研发提供新思路和依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 成年清洁级雄性Wister大鼠，体重200 g～250 g，由北京海淀兴旺动物养殖场提供。大鼠自由摄食饮水，自然光照，室温25.5 ℃±2.0 ℃饲养。
1.1.2 药品、试剂及实验仪器 TEN在山西大学中医药现代研究中心提取，1 g TEN相当于生药远志25 g，4 ℃避光保存，实验时以生理盐水配置成溶液；PTZ购于Sigma公司，将其溶于生理盐水配成1%溶液(10 mg/mL)后置于4 ℃环境保存；脑立体定位仪购于深圳瑞沃德公司，多道生理信号采集系统(6240C型)购于成都仪器厂，Morris水迷宫图像采集分析系统购于荷兰诺达思科技信息公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组及造模 将32只雄性Wister大鼠随机分为对照组(8只)、癫痫模型组(12只)、TEN组(12只)。癫痫模型组给予腹腔注射致惊厥剂量的戊四氮[Pentylenetetrazole，PTZ(40 mg/kg)]，注射时间为每日08：00～09：00，注射完观察大鼠2 h，记录发作次数和分级，每隔1日称大鼠体重进行剂量调整，连续给药28 d，停药7 d；再以相同剂量点燃，以连续2次以上4级以上发作视为造模成功，惊厥发作以Racine法分级标准进行判断。TEN组在腹腔注射PTZ同时灌服TEN溶液 (375 mg/kg)，给药35 d，之后腹腔注射点燃。对照组则给予生理盐水灌胃及腹腔注射。
1.2.2 Morris水迷宫实验 造模成功后各组大鼠进行Morris水迷宫实验。标准大鼠迷宫(直径150 cm)分为均等的4个象限，入水点为4个象限贴壁的正中部位。迷宫上方给予参照物以供大鼠识别，将平台放入第一象限的正中部位，将平台放在水平面以下1 cm，水温为23 ℃±2 ℃，实验图像由迷宫正上方摄像头记录，数据由摄像头连接电脑记录。实验室要遮蔽太阳光，室内给予节能灯照明。实验步骤：①定位航行实验：此部分实验持续5 d，每次将大鼠面向池壁分别从四个象限放入水中，由电脑系统记录其找到平台所需的时间，即逃避潜伏期。若大鼠可登上平台，记录时间并让其停留10 s，以便强化记忆；若120 s内大鼠仍未登上平台，则将其放至平台10 s，实验结束，记录其逃避潜伏期为120 s；②空间探索实验：第6天将原平台撤离，让大鼠在无平台的情况在迷宫游泳120 s，记录其跨越原平台次数，此部分实验进行2次。
1.2.3 电生理实验 腹腔注射乌拉坦(1.5 g/kg)将大鼠麻醉，室温保持在23 ℃～25 ℃。脑立体定位固定大鼠头部，头颅顶部备皮，做正中切口，从双眼连线中心后侧0.5 cm向后切开约2 cm，采用10%过氧化氢浸润的棉球破坏清理筋膜，根据《大鼠颅脑定位图谱》对大鼠海马准确定位，并以前后囟点为参考点将大鼠头部调整为同一水平线，按照坐标(刺激电极为X：-4.2 mm，Y：3.8 mm；记录电极为X：-3.4 mm，Y：2.5 mm)定位后，将颅骨部位定位Z轴为0 mm。将同心圆双极刺激电极和自制单极记录电极捆绑以固定其相对位置垂直插入脑组织[13]，测试为正电流，设定刺激电流强度1.2 A，波宽0.2 ms，10 次/min持续刺激，调节脑立体定位仪使电极沿Z轴逐渐下降(以0.1 mm为单位)，出现场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)波形时继续缓慢下降(以0.01 mm为单位)，直至fEPSP波形不再增大，此时电极已到目标区域，即为刺激(schafer侧支)和记录部位(CA1区放射层)。选取的基础电流为引起最大幅度fEPSP 50%时电流强度，波宽为0.2 ms，间隔6 s，记录30 min以上确保突触传递稳定。诱发LTP的高频刺激(HFS)为200 Hz，时程1 s，共3个串刺激，串间隔30 S ，HFS后fEPSP增长为基础波150%以上视为诱导LTP成功；若成功则记录1 h，并由多通道生理信号采集系统在电脑上储存和分析。
2 结 果
2.1 癫痫模型结果 对照组8只大鼠均存活；模型组大鼠由于癫痫发作死亡3只，未达点燃标准1只，造模成功8只；远志防治组大鼠癫痫发作死亡2只，未达点燃标准1只，造模成功9只。
2.2 Morris水迷宫结果 各组大鼠逃避潜伏期均呈现缩短趋势，提示各组大鼠均具有空间学习记忆能力。模型组的逃避潜伏期较对照组，显着延长(Plt;0.05)；TEN组的逃避潜伏期较模型组，显着缩短(Plt;0.05)。详见表1。
组别n第1天第2天第3天第4天第5天对照组871.89±14.23 31.50±18.78 28.36±11.85 15.43±5.61 11.33±5.53 模型组895.25±16.951)63.36±14.781)44.75±12.931)30.88±6.901)21.81±6.331)TEN组973.17±15.862)44.75±14.262)30.57±10.282)19.83±4.562)12.50±7.502) 与对照组比较,1)Plt;0.05;与模型组比较,2)Plt;0.05。
2.2 大鼠空间探索实验结果比较 与对照组比较，模型组跨台次数，显着减少(Plt;0.05)；TEN组与模型组比较，跨台次数显着增多(Plt;0.05)。详见表2。
组别n跨越原平台次数对照组89.50±1.60 模型组84.13±1.251)TEN组98.25±1.492) 与对照组比较,1)Plt;0.05;与模型组比较,2)Plt;0.05。
2.3 电生理实验结果 模型组高频刺激后相同时间点的斜率分与对照组比较显着降低(Plt;0.05)；TEN组高频刺激后相同时间点的斜率与模型组比较显着升高(Plt;0.05)。详见表3。
组别n1min30min60min对照组8218.41±11.36 196.58±10.08 183.10±11.36 模型组8173.31±15.761)149.61±12.871)125.96±13.021)TEN组9190.98±10.162)174.19±12.142)152.61±8.912) 与对照组比较,1)Plt;0.05;与模型组比较,2)Plt;0.05。
3 讨 论
癫痫与认知功能损害的关系引起医学界广泛关注，目前认为癫痫后认知功能损害主要与起病年龄[14]、癫痫发作次数、严重程度[15]、治疗药物[16-18]有关。迄今为止对癫痫后认知功能障碍的发病机制仍未完全阐明且无有效治疗手段。中药远志是一味益智安神的良药，在临床上应用已有千年历史。近年来有关远志及其有效成分TEN对学习记忆作用的研究日益增多[5-10，19-20]，但远志及TEN对癫痫后认知功能障碍方面的研究报道较少。
本实验应用PTZ诱导癫痫动物模型对癫痫后认知障碍进行研究[21]，由于PTZ不损害脑组织结构，对大鼠记忆能力和运动功能无明显影响，因此该癫痫模型常作为研究癫痫与认知功能障碍关系的理想模型。水迷宫结果显示模型组与对照组比较，逃避潜伏期明显延长，撤离平台后，跨越原平台次数明显减少，表明癫痫模型组大鼠出现空间学习记忆能力减退，TEN组与模型组比较，逃避潜伏期缩短，撤离平台后，跨越原平台次数增多，说明TEN可改善癫痫模型大鼠空间学习记忆能力。
海马是中枢神经系统中与学习记忆密切相关的脑区之一，LTP是一种由强直刺激作用兴奋性突触传递通路诱发的突触传递效率长时间增强的现象。海马LTP已广泛认为是学习和记忆机制的细胞学模型之一[12]。本实验正常组大鼠高频刺激后fEPSP值即刻达到约218%，30 min时降到约196%，60 min时仍维持在约183%；癫痫模型大鼠高频刺激诱发的fEPSP值约173%，60 min时约125%，明显低于正常组；TEN组高频刺激后fEPSP值即刻达到约190%，60 min末仍维持在约152%，明显高于模型组，表明TEN可提高海马突触传递效能，改善癫痫后LTP的抑制。
综上所述，TEN可改善癫痫模型大鼠空间学习记忆能力及海马LTP抑制。既往研究表明，TEN改善癫痫后认知障碍的部分机制可能是通过提高癫痫模型大鼠海马CA1区的N-甲基-D-d冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体表达[20]及CA1区烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha-7，nAChRɑ7)实现。因此，TEN可能通过刺激谷氨酸能及胆碱能信号通路参与学习记忆过程的形成，本研究为临床新药研发提供新思路和依据。
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2017-03-03)
(本文编辑 薛妮)
The Influence of Tenuigenin on the Ability of Spatial Learning Memory and Hippocampal Long-term Potentiation in Epilepsy Model Rats
Jing Wei，Ma Biao，Li Yan， Li Xinyi
Shanxi Dayi Hospital，Shanxi Academy of Medical Science，Taiyuan 030032， Shanxi China
Objective To observe the effects of Tenuigenin (TEN) on the ability of spatial learning and memory and long-term potentiation (LTP) in epilepsy model rats by intraperitoneal injection of Pentylenetetrazole (PTZ) solution. Methods Male wistar rats were randomly divided into control group，epilepsy model group，and tenuigenin group.Morris water maze test was performed to assess the ability of spatial learning and memory of animals. Additionally， electrophysiological technique was used to observe the changes in rat hippocampal LTP through the comparison of field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) amplitudes in hippocampal CA1 region before and after high stimulation(HFS). Meanwhile， the regulation effect of TEN on above indices were studies.Results Compared with control group，the ability of spatial learning and memory as well as LTP were obviously decreased in epilepsy model group，however，TEN improved the abnormal changes of above indices.Conclusion TEN can improve the ability of learning and memory abilities and promote in vivo hippocampal LTP.
epilepsy；learning memory；Tenuigenin；hippocampus；long-term potentiation
R741 R285.5
A
10.3969/j.issn.1672-1349.2017.20.007
1672-1349(2017)20-2540-03
山西省青年科技研究基金(No.2013021036-1)
1.山西医学科学院/山西大医院(太原 030032) ，E-mail：jingweistar@163.com；2.山西省晋中市第一人民医院；3.汾西矿务局集团职工总医院
信息：景玮，马彪，李艳，等.远志总皂苷对癫痫模型大鼠学习记忆及海马LTP的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(20)：2540-2542.
