木犀草素对心力衰竭大鼠心肌炎症反应和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

史朋晓，宋媛媛，闫洪娟

心力衰竭发病机制复杂，免疫炎症反应在其中发挥着重要作用，免疫炎症反应异常激活促进心力衰竭进展，抗炎可能是治疗心力衰竭的新方法[1]。木犀草素是从多种瓜果蔬菜和天然药材中分离出的一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种活性[2]。刘昕等[3]研究显示，木犀草素通过减轻心肌细胞线粒体损伤，抑制外周血淋巴细胞DNA损伤发挥对心力衰竭的保护作用[4]。炎症反应在心力衰竭发病中发挥着重要作用，Toll样受体4/髓样分化因子88/核转录因子-κB(TLR4/MyD88/NF-κB)信号通路为介导炎症反应的主要通路[5]。本研究观察木犀草素对心力衰竭大鼠心肌炎症反应和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响，从炎症反应方面进一步探讨木犀草素对心力衰竭保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和仪器 实验动物：清洁级雄性SD大鼠[河北省实验动物中心，许可证号：SCVK(冀)2014-0015]，体质量210～230 g。实验试剂和仪器：木犀草素(美国Sigma公司)，苏木精、伊红(上海朗瑞)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(加拿大HCB公司)，放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，兔抗鼠白细胞介素1β(IL-1β)多克隆抗体、兔抗鼠白细胞介素6(IL-6)多克隆抗体、兔抗鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)多克隆抗体、兔抗鼠TLR4多克隆抗体、兔抗鼠MyD88多克隆抗体、兔抗鼠NF-κB p65多克隆抗体(英国Abcam公司)；超声仪(HP SONOS 5500，美国惠普公司)。

1.2 实验动物分组 采用随机数字表法将51只大鼠分为假手术组(S组)、心力衰竭组(H组)和木犀草素治疗组(L组)，每组17只大鼠。

1.3 心力衰竭模型建立 采用开胸手术建立心力衰竭动物模型。H组和L组大鼠建立模型：将大鼠称重，麻醉成功后，固定于手术板上，刮净胸骨左侧心前区毛发，颈部垫高，气管插管，连接呼吸机，常规消毒、铺巾，于大鼠心尖搏动最强处沿肋骨切开皮肤，分离筋膜、肌肉、胸膜，打开腹腔，暴露心脏，小镊子撕破心包，挤压右侧胸廓，暴露心脏左心室，辨别肺动脉圆锥和左心耳，在两者交界下方2 mm处使用缝合针结扎心脏前降支，观察心脏由红润变苍白时，迅速将心脏归位。S组大鼠结扎时打松结，其他步骤同建模组。术后3周，采用心脏超声判断心力衰竭情况，以左室射血分数(LVEF)<50%为心力衰竭模型建立成功。建模失败的大鼠重新取大鼠按照上述步骤建立模型作为补充。

1.4 给药 建模成功后，L组大鼠给予50 mg/(kg·d)木犀草素(体积3 mL)灌胃，S组和H组大鼠给予50 g/L羧甲基纤维素钠3 mL灌胃，共10 d[3-4]。

1.5 心脏超声测定心脏收缩功能 给药10 d后，于第11天进行心脏超声检查，指标包括LVEF、短轴缩短率(FS)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)。

1.6 实验取材 超声检查结束后，使用内眦取血法采集血液3 mL，以3 000 r/min离心10 min，分离血清备用。取血后称重大鼠，麻醉处死大鼠，开胸，取出心脏，将心脏横切为两块，一部分组织置于甲醛溶液固定，另一部分组织置于液氮中冻存。

1.7 苏木精-伊红(HE)染色 将甲醛溶液中的心脏组织取出，梯度乙醇脱水、二甲苯脱乙醇，石蜡包埋，切成5 μm切片，进行常规HE染色：二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水，苏木精染色5～10 min，伊红染色1 min，乙醇脱水，二甲苯透明，封片后，镜下观察心肌组织形态学变化。

1.8 Masson染色 取心肌组织石蜡切片，脱蜡至水，Masson染色液染色5 min，磷钼酸染色5 min，亮绿染色2 min，分化液分化1 min，乙醇脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察染色情况，采用Image-Pro Plus图像分析软件计算胶原面积比，胶原面积比=胶原纤维面积/心肌面积×100%。

1.9 血清脑钠肽(BNP)、IL-1β、IL-6、TNF-α水平测定 采用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.10 心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平测定 采用蛋白免疫印迹法测定心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平，取出液氮中心肌组织，剪取100 mg置于EP管中，剪碎，加入RIPA裂解液，使用研磨器充分研磨制作匀浆，提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，脱脂奶粉封闭液中封闭2 h，加入一抗(1∶300)以β-actin为内参，过夜孵育，加入二抗孵育1 h，经洗涤、显影、灰度扫描，采用Image J软件测定条带灰度值。蛋白水平=目标蛋白灰度值/β-actin条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组心脏超声指标比较 与S组比较，H组LVEF、FS降低(P<0.05)，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV增加(P<0.05)；与H组比较，L组LVEF、FS升高(P<0.05)，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV降低(P<0.05)。详见表1。

表1 各组心脏超声指标比较(±s)

2.2 木犀草素对心脏HE染色的影响 HE染色结果显示：S组大鼠心肌排列整齐，结构清晰，无坏死心肌和炎症浸润；H组大鼠心肌排列紊乱，可见大片心肌坏死和炎症浸润；L组大鼠心肌排列较整齐，心肌坏死和炎症浸润较轻。详见图1。

图1 各组心肌组织HE染色图(×200)

2.3 木犀草素对心脏Masson染色的影响 Masson染色结果显示：心肌细胞染色呈红色，胶原纤维染色呈蓝色。S组心肌胶原纤维含量少，H组心肌胶原纤维明显增多，L组心肌胶原纤维较H组明显减少。详见图2。与S组比较，H组胶原面积比增加(P<0.05)；与H组比较，L组胶原面积比降低(P<0.05)。详见表2。

图2 各组心肌组织Masson染色图(×200)

表2 各组心肌组织胶原面积比比较(±s)

2.4 各组血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 与S组比较，H组血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；与H组比较，L组血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。详见表3。

表3 各组血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较(±s) 单位：pg/mL

2.5 各组心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达比较 与S组比较，H组心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达升高(P<0.05)；与H组比较，L组心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达降低(P<0.05)。详见表4、图3。

表4 各组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白比较(±s)

图3 各组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白条带图

2.6 各组心肌组织TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白表达水平比较 与S组比较，H组心肌组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05)；与H组比较，L组心肌组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)。详见表5、图4。

表5 各组心肌组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平比较(±s)

图4 各组心肌组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白条带图

3 讨 论

心力衰竭不仅严重影响病人生活质量，也是严峻的公共卫生问题，故探讨心力衰竭的机制具有重要的意义。建立良好的动物模型对研究心力衰竭具有重要的临床价值。良好的动物模型可复制心力衰竭发病的整个过程，通过结扎冠状动脉导致心肌缺血坏死，最终引起心力衰竭发生，接近临床心力衰竭。本研究采用结扎心脏冠状动脉前降支建立心力衰竭大鼠模型，结果显示：心力衰竭模型组大鼠LVEF、FS降低，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV及血清BNP水平升高；心肌坏死和炎症浸润严重，胶原面积明显增加。提示心力衰竭模型建立成功。

随着心室重构学说和神经激素学说的提出，心力衰竭细胞因子学说逐渐被提出。细胞因子学说认为心力衰竭进展部分原因是心脏本身和外周循环炎性因子发生级联反应导致的毒性作用造成的。有研究显示，炎性因子水平升高导致的炎症反应在心力衰竭进展中发挥着重要作用，是引起心室重构和心力衰竭恶化的重要原因[6]。心力衰竭时，IL-1β、IL-6、TNF-α等多种炎性因子水平明显升高；这些炎性因子过度表达引起心排血量和心肌收缩力降低，诱导心肌细胞坏死和凋亡，造成心肌重塑恶性循环，进一步促进疾病发展[7]。本研究结果显示：心力衰竭模型大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平升高。表明心力衰竭模型大鼠心肌组织和全身均存在炎症反应。

木犀草素最初是从木犀草枝、茎、叶中分离得到的，是黄酮类植物中的一种化合物，通常以糖基化或糖苷形式在菊科、豆科等多种植物中存在，是山楂、野菊花、金银花的主要活性成分之一[8-9]。木犀草素除具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化应激等作用外，对心血管也有保护作用[10]。木犀草素可保护缺氧-复氧损伤的心肌细胞[11]，通过抑制心肌细胞中缺氧依赖性L型钙通道改善心脏损伤[12]，激活过氧化物酶Ⅱ减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[13]，抗氧化保护心肌缺血/再灌注损伤[14]。抗炎是木犀草素的主要作用之一，本研究从炎症反应角度探讨木犀草素对心力衰竭大鼠的作用，结果显示：心力衰竭大鼠经木犀草素治疗后LVEF、FS升高，LVESD、LVESD、LVEDV、LVESV降低，血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平降低。HE染色显示心肌坏死和炎症浸润明显减轻，Masson染色显示心肌组织胶原面积比降低。表明木犀草素可能通过抑制心肌组织及全身炎症反应，保护心肌细胞，减轻心肌坏死和炎症反应，减小心肌胶原面积，发挥对心力衰竭的保护作用。

心脏炎症反应包括自然免疫反应和获得性免疫反应，自然免疫反应的主要特征为诱导产生炎性因子。本研究中，心力衰竭模型大鼠心肌组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平升高。心肌缺血并导致心力衰竭时发生自然免疫反应和炎症反应。TLRs为一种重要的模式识别受体家族，可诱发自然免疫反应；TLR4为TLRs的一种类型，在心肌细胞中表达；TLR4可激活MyD88通路，最终激活NF-κB，NF-κB是激活炎症反应的关键转录因子[15-16]。心肌梗死等心脏疾病发病过程中，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活，TLR4、MyD88、NF-κB p65水平升高[17]。本研究结果显示，心力衰竭模型大鼠心肌组织TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活；心力衰竭模型大鼠经木犀草素治疗后心肌组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平降低。木犀草素通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制炎症反应发生[18]；通过TLR/MyD88/NF-κB信号通路，进而抑制急性痛风性关节炎大鼠炎症反应[19]；通过抑制NF-κB活化抑制金黄色葡萄球菌诱发的乳腺炎炎症反应[20]；通过TLR4/NF-κB干预脑梗死大鼠脑皮质炎症反应[21]。结合本研究结果和既往研究结果可见：木犀草素可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活，降低心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子水平，抑制心肌组织炎症反应，从而发挥对心力衰竭的保护作用。

综上所述，木犀草素对心力衰竭大鼠心肌组织的保护作用可能与抑制心肌组织炎症反应有关，其机制可能为木犀草素通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，进而抑制心肌组织炎症反应，发挥对心肌组织的保护作用。