秋水仙碱通过激动PI3K/AKT/eNOS信号通路对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

李颖 吴曼 陈智 王冠 郭俊玲

摘要 目的：探究秋水仙碱通过调节磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/内皮型一氧化氮合酶（eNOS）信号通路对急性心肌梗死（AMI）大鼠心功能的影响。方法：78只大鼠中随机选取12只作为假手术组，剩余大鼠构建AMI模型，造模成功大鼠分为模型组、秋水仙碱组［4 mg/（kg·d）］、秋水仙碱［4 mg/（kg·d）］＋LY294002（20 mg/mL）组、秋水仙碱［4 mg/（kg·d）］＋MK-2206（60 μg/mL）组、秋水仙碱［4 mg/（kg·d）］＋L-NAME（1.6 mg/mL）组，每组12只。超声心动图检测大鼠左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、射血分数（EF）及短轴缩短率（FS）。处死大鼠，苏木素-伊红（HE）染色检测大鼠心肌组织石蜡切片病理学变化；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡率；酶联免疫吸附实验（ELISA）测定大鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）以及心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）水平；免疫印迹法（Western Blot）测定大鼠心肌组织PI3K/AKT/eNOS通路蛋白表达。结果：与假手术组相比，模型组大鼠LVESD、LVEDD，血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平，心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率升高，EF、FS水平，心肌匀浆SOD、CAT，心肌组织磷酸化PI3K（p-PI3K）/PI3K、磷酸化AKT（p-AKT）/AKT、磷酸化eNOS（p-eNOS）/eNOS降低（P＜0.05）；与模型组相比，秋水仙碱组大鼠LVESD、LVEDD，血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平，心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率降低，EF、FS水平，心肌匀浆SOD、CAT，心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS升高（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，秋水仙碱＋LY294002组、秋水仙碱＋MK-2206组、秋水仙碱＋L-NAME组大鼠LVESD、LVEDD，血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平，心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率升高，EF、FS水平，心肌匀浆SOD、CAT，心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS降低（P＜0.05）。结论：秋水仙碱可能通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路对AMI大鼠发挥心功能保护作用。

关键词 急性心肌梗死；秋水仙碱；心功能；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶信号通路；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.009

Colchicine Promotes Cardiac Function in Rats with Acute Myocardial Infarction by Activating PI3K/AKT/eNOS Signaling Pathway

LI Ying， WU Man， CHEN Zhi， WANG Guan， GUO Junling

Tangshan People′s Hospital， Tangshan 063000， Hebei， China

Corresponding Author   GUO Junling， E-mail： sweetheart0817@126.com

Abstract Objective：To investigate the effect of colchicine on cardiac function in rats with acute myocardial infarction（AMI） by regulating phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）/endothelial nitric oxide synthase（eNOS） signaling pathway.Methods：There were 78 rats，12 were randomly selected as the sham-operated group，and the remaining 66 rats were used to construct an AMI model.Rats with successful modeling were divided into model group，colchicine group［4 mg/（kg·d）］，and colchicine［4 mg/（kg·d）］＋LY294002（20 mg/mL） group，colchicine［4 mg/（kg·d）］）＋MK-2206（60 μg/mL） group，colchicine［4 mg/（kg·d）］＋L-NAME（1.6 mg/mL） group，with 12 rats in each group.Echocardiography was applied to measure left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end-systolic diameter（LVESD），ejection fraction （EF），and short-axis shortening（FS） in rats.Rats were sacrificed，and hematoxylin-eosin（HE） staining was used to measure the pathological changes in rat myocardial paraffin sections.Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling（TUNEL） method was implemented to measure cardiomyocyte apoptosis rate.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） method was implemented to measure the levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin（IL）-6，creatine kinase-MB（CK-MB） in rat serum and superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），and catalase（CAT） in myocardial tissue homogenate.Western Blot was performed to determine the protein expression of PI3K/AKT/eNOS pathway in rat myocardial tissue.Results：Compared with sham-operated group，the LVESD，LVEDD，serum CK-MB，TNF-α，IL-6 levels，myocardial homogenate MDA，and myocardial cell apoptosis rate in model group increased，and the EF，FS levels，myocardial homogenate SOD，CAT，myocardial tissue p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and p-eNOS/eNOS decreased（P＜0.05）.compared with model group，the LVESD，LVEDD，serum CK-MB，TNF-α，IL-6 levels，myocardial homogenate MDA，and myocardial cell apoptosis rate in colchicine group decreased，and the EF，FS levels，myocardial homogenate SOD，CAT，myocardial tissue p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and p-eNOS/eNOS increased（P＜0.05）.Compared with colchicine group，the LVESD，LVEDD，serum CK-MB，TNF-α，IL-6 levels，myocardial homogenate MDA，and myocardial cell apoptosis rate in colchicine＋LY294002 group，colchicine＋MK-2206 group，and colchicine＋L-NAME group increased，and the EF，FS levels，myocardial homogenate SOD，CAT，myocardial tissue p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and p-eNOS/eNOS decreased（P＜0.05）.Conclusion：Colchicine may exert some protective effect on cardiac function in AMI rats by activating the PI3K/AKT/eNOS pathway.

Keywords acute myocardial infarction; colchicine; cardiac function; phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase signaling pathway; experimental study

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）主要病理特征表现为冠状动脉持续性缺血缺氧导致的

基金项目 河北省医学科学研究课题计划项目（No.20210316）

作者单位 唐山市人民医院（河北唐山 063000）

通讯作者 郭俊玲，E-mail：sweetheart0817@126.com

引用信息 李颖，吴曼，陈智，等.秋水仙碱通过激动PI3K/AKT/eNOS信号通路对急性心肌梗死大鼠心功能的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（7）：1219-1224.

心肌坏死，严重者可并发心力衰竭、休克等。AMI多发生在动脉粥样硬化基础上，发作后产生的心功能障碍严重影响病人生活质量，因此，缓解心肌细胞坏死、改善心功能是AMI治疗的主要研究方向［1］。但目前临床上可用于缓解AMI发作后心力衰竭的药物效果并不令人满意，急需进一步的研究开发出更多、更有效的挽救心功能的药物。

秋水仙碱（colchicine）是从秋水仙中提取出来的生物碱，是秋水仙的药用有效成分，可抑制有丝分裂，使细胞分裂中期停滞，在遗传学的研究中广泛使用，可用于治疗癌症、痛风等疾病［2-3］。近年来研究发现，秋水仙碱在心血管疾病中也能起到很好的治疗作用。一项大型双盲随机对照研究发现，心肌梗死发生后每日低剂量的秋水仙碱可显着降低梗死后并发症的发生率［4］。过度炎症反应及继发的纤维化是AMI后心肌纤维化和心功能衰竭的主要原因。秋水仙碱具有广谱的抗炎、抗纤维化的作用，可通过抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）介导的细胞焦亡过程挽救AMI诱导的心肌细胞死亡，增强心肌顺应性而恢复AMI后的心脏搏动功能［5］。同时，秋水仙碱还能选择性抑制炎性细胞的趋化和促炎分化，抑制炎性因子的分泌和炎症信号通路的激活，实现预防AMI后心肌的二次损伤和心功能下降［6］。既往已有很多研究聚焦于秋水仙碱对心包炎的防治作用，但秋水仙碱挽救AMI后大鼠心功能的分子机制目前还有待进一步研究［7］。

内皮型一氧化氮合酶（eNOS）是心肌细胞合成一氧化氮（NO）的限速酶，在抗氧化损伤中发挥重要作用，而氧化应激损伤是AMI后心肌炎症和心功能障碍的重要机制［8-9］。既往研究发现，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路可能通过磷酸化eNOS（p-eNOS）降低过氧化损伤，并参与心肌保护过程［10］。本研究构建了AMI大鼠模型，基于PI3K/AKT/eNOS通路探究了秋水仙碱对AMI大鼠心功能的影响，为AMI的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物以及主要试剂、仪器

本研究所有实验内容均在唐山市人民医院科研平台完成。无特定病原体（SPF）级SD大鼠90只（雄性），体质量300～350 g，9周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2021-0006。秋水仙碱（B71404）购自上海源叶；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（C0105S）、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）试剂盒（C1091）、蛋白提取试剂盒（P0033）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（S0131S）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（S0101S）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（S0051）购自上海碧云天；肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒（ml059533）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒（ml002859）、白细胞介素-6（IL-6）检测试剂盒（ml102828）购自上海酶联；PI3K抑制剂LY294002（S1105）、AKT抑制剂MK-2206（S1078）、eNOS抑制剂L-NAME（S2877）购自Selleck；磷酸化PI3K（p-PI3K，ab278545）、PI3K（ab154598）、磷酸化AKT（p-AKT，ab38449）、AKT（ab18785）、p-eNOS（ab215717）、eNOS（ab76198）、GAPDH（ab8245）抗体、山羊抗鼠二抗（ab6728）购自美国Abcam。心电图仪（ECG-2110型）购自涵飞医疗，小动物多普勒超声心动仪（Vevo770）购自Visual Sonics Inc。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立以及分组情况

78只SD大鼠，随机选取12只作为假手术组，剩余大鼠参照文献［11］构建AMI模型，即大鼠仰卧固定于手术台，戊巴比妥钠（3%）腹腔麻醉大鼠，连接动物呼吸机给予正压通气，开胸暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支，心电图显示ST段持续性抬高代表建模成功，缝合胸腔，自主呼吸恢复后拔管，给予抗生素防治感染。造模成功72只，造模成功率为92.31%。假手术组仅穿针，不结扎。造模成功大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组［4 mg/（kg·d）］［12］、秋水仙碱＋LY294002组（20 mg/mL）［13］、秋水仙碱＋MK-2206组（60 μg/mL）［14］、秋水仙碱＋L-NAME组（1.6 mg/mL）［15］。假手术组给予等量生理盐水。均为每日1次，持续给药2周。

1.2.2 心功能检测

末次给药后，麻醉大鼠，采用小动物多普勒超声心动仪测定大鼠左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、射血分数（ejection fraction，EF）及短轴缩短率（fractional shortening，FS）。取连续3个心动周期，测定平均值。

1.2.3 心肌酶、炎性指标检测

心功能检测结束后，取大鼠腹主动脉血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，严格按照试剂盒说明书的步骤检测血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平。

1.2.4 氧化应激指标检测

血清指标检测结束后，剥离大鼠心脏，将其切分为3部分，一部分置于冻存管中，－80 ℃保存；一部分用4%多聚甲醛固定；另一部分按照1∶9的比例加入预冷的生理盐水研磨后，离心，取上清液，制备成10%的组织匀浆，检测匀浆中MDA、SOD、CAT水平。

1.2.5 HE染色观察大鼠心肌病理变化

取甲醛固定的心脏组织，常规制备石蜡切片，HE染色试剂盒对石蜡切片进行HE染色，封片，镜下观察大鼠心肌病理变化。

1.2.6 TUNEL法观察大鼠心肌凋亡

取石蜡切片，脱蜡，按照TUNEL试剂盒说明书进行染色，封片，显微镜下观察凋亡细胞情况（棕褐色染色），计算凋亡率，凋亡率（%）＝凋亡细胞/总细胞×100%。

1.2.7 免疫印迹法（Western Blot）检测大鼠心肌组织PI3K/AKT/eNOS信号通路蛋白表达

取冷冻保存的心肌组织，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，静置后离心，提取上清液为总蛋白。采用二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量，30 μg/孔蛋白质上样，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转膜，封闭（5%脱脂奶粉），加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-eNOS、eNOS、GAPDH一抗，过夜，加入二抗（1∶5 000），孵育1 h后，采用增强型化学发光试剂（ECL）显色，计算条带的相对表达。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。定量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较进一步采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 秋水仙碱对大鼠心功能的影响

与假手术组相比，模型组大鼠LVESD、LVEDD升高，EF、FS降低（P＜0.05）；与模型组相比，秋水仙碱组大鼠LVESD、LVEDD降低，EF、FS升高（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，秋水仙碱＋LY294002组、秋水仙碱＋MK-2206组、秋水仙碱＋L-NAME组LVESD、LVEDD升高，EF、FS降低（P＜0.05）。详见表1。

2.2 秋水仙碱对大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，秋水仙碱组大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，秋水仙碱＋LY294002组、秋水仙碱＋MK-2206组、秋水仙碱＋L-NAME组大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。详见表2。

2.3 秋水仙碱对大鼠心肌组织SOD、CAT、MDA水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织SOD、CAT水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，秋水仙碱组大鼠心肌组织SOD、CAT水平明显升高，MDA水平明显降低（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，秋水仙碱＋LY294002组、秋水仙碱＋MK-2206组、秋水仙碱＋L-NAME组大鼠心肌组织SOD、CAT水平明显降低，MDA水平明显升高（P＜0.05）。详见表3。2.4 HE染色观察秋水仙碱对大鼠心肌组织病理变化的影响

假手术组大鼠心肌组织排列整齐、染色均匀，无心肌细胞坏死；模型组大鼠染色不均，细胞形态不规则，可见大量炎性浸润；与模型组相比，秋水仙碱组大鼠心肌组织排列整齐，炎性浸润减少；与秋水仙碱组相比，秋水仙碱＋LY294002组、秋水仙碱＋MK-2206组、秋水仙碱＋L-NAME组大鼠心肌病变程度有所加重。详见图1。

2.5 TUNEL染色观察秋水仙碱对大鼠心肌细胞凋亡的影响

与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组相比，秋水仙碱组大鼠心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，秋水仙碱＋LY294002组、秋水仙碱＋MK-2206组、秋水仙碱＋L-NAME组大鼠心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05）。详见图2、表4。

2.6 秋水仙碱对大鼠心肌组织PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS降低（P＜0.05）；与模型组相比，秋水仙碱组大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS升高（P＜0.05）；与秋水仙碱组相比，秋水仙碱＋LY294002组、秋水仙碱＋MK-2206组、秋水仙碱＋L-NAME组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS均降低（P＜0.05）。详见图3、表5。

3 讨 论

AMI是心血管疾病病死率居高不下的重要原因之一。AMI后心肌细胞的坏死会影响心功能，心功能不全是AMI病人生存质量下降的原因之一，也是急需解决的问题。本研究通过对SD大鼠造模，成功构建了AMI大鼠模型，AMI大鼠LVESD、LVEDD升高，EF、FS降低，即AMI大鼠心功能明显下降。炎症、氧化应激在AMI大鼠的心功能不全中发挥关键作用。心肌缺氧缺血后会激活氧化应激，产生活性氧（ROS），释放TNF-α、IL-6等炎性因子，促进AMI的发展［12-16］。AMI模型大鼠心肌细胞排列不规则，可见大量炎性细胞浸润，CK-MB、MDA、TNF-α、IL-6水平明显升高，SOD、CAT水平明显降低。提示AMI大鼠氧化应激、炎症水平升高，心肌损伤剧烈。

本研究给予AMI大鼠秋水仙碱后，大鼠LVESD、LVEDD明显降低，EF、FS明显升高，提示秋水仙碱可改善AMI大鼠心功能。eNOS是Ca2＋依赖性一氧化氮合酶（NOS），可表达于心肌细胞，内皮细胞受机械、生化刺激后，细胞内Ca2＋释放，与钙调蛋白结合激活eNOS，可将氮原子氧化为一氧化氮（NO），NO可与平滑肌细胞的血红素结合，通过激活鸟苷酸环化酶等维持血管舒张状态，在心肌保护中发挥作用［17］；在各因素影响下，eNOS四级结构改变，不产生NO，产生超氧化物，即eNOS脱偶联，可增加内皮细胞氧化压力，损伤血管内皮，而ROS水平升高又进一步加深eNOS脱偶联，形成恶性循环。Chen等［18］研究显示，高表达eNOS的间充质干细胞可促进心肌梗死大鼠的心脏恢复。Calvert等［19］研究显示，二甲双胍通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）-eNOS介导的信号通路保护心肌梗死细胞。PI3K/AKT可参与内皮细胞生长的调控［20］。PI3K/AKT激活可保护2型糖尿病小鼠的心功能［21］。此外，PI3K/AKT可激活eNOS磷酸化，参与eNOS的脱偶联。秋水仙碱具有高效抗炎作用，可减少NLRP3激活的炎症，改善肥胖相关代谢失调［22］，对心肌梗死大鼠炎症具有抑制作用［23］。本研究中，给予AMI大鼠秋水仙碱后，血清CK-MB明显降低，心肌细胞排列整齐，炎性细胞浸润明显减少，同时血清TNF-α、IL-6、MDA水平明显降低，心肌组织SOD、CAT水平明显升高，提示秋水仙碱可抑制AMI大鼠炎症与氧化应激；AMI大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS水平降低，经秋水仙碱处理后大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS水平升高，提示秋水仙碱对AMI大鼠的心功能有保护作用，可能与激活PI3K/AKT/eNOS通路有关。在高剂量秋水仙碱处理基础上分别增加PI3K、AKT、eNOS抑制剂，秋水仙碱的心功能保护作用被明显削弱，进一步提示秋水仙碱可能通过激活PI3K/AKT/eNOS通路在AMI大鼠中发挥心功能保护作用。

综上所述，秋水仙碱可能通过激活PI3K/AKT/eNOS通路抑制大鼠氧化应激，对AMI大鼠发挥心功能保护作用。但本研究仍存在一定局限性，PI3K/AKT/eNOS属于多功能、多靶点通路，秋水仙碱发挥心功能保护作用的机制仍需探讨。

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（收稿日期：2022-08-25）

（本文编辑王丽）