天香丹通过GRP78/NLRP3信号通路调控内质网应激抗动脉粥样硬化的作用机制研究

张夏夏 白银雪 吴丹丹 孙龙飞 任珊 安冬青

摘要  目的：基于葡萄糖调节蛋白78（GRP78）/NOD样受体蛋白3（NLRP3）信号通路探讨天香丹通过调控内质网应激抗动脉粥样硬化的作用机制。方法：将雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组、天香丹组，每组11只，给予高脂饲料诱导动脉粥样硬化模型；另取10只雄性C57BL/6J小鼠作为正常组。于造模10周后给予相应药物治疗，连续干预12周。采用苏木精-伊红（HE）染色观法察胸主动脉病理特点；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）、活性氧（ROS）含量；免疫组织化学法（IHC-P）检测胸主动脉中GRP78和NLRP3蛋白阳性表达水平。结果：各实验组存活6只。与模型组比较，阿托伐他汀组和天香丹组IL-1β、IL-18、ROS表达含量均降低（P＜0.05或P＜0.01）；GRP78、NLRP3蛋白阳性表达均明显减少（P＜0.05或P＜0.01）。结论：天香丹能有效改善动脉粥样硬化性心血管疾病小鼠炎症反应，其作用机制可能与调控内质网应激GRP78/NLRP3信号通路抑制炎症小体活化、减轻动脉粥样硬化炎症损伤有关。

关键词  动脉粥样硬化；天香丹；内质网应激；葡萄糖调节蛋白78；NOD样受体蛋白3；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.11.006

The Anti-atherosclerosis Mechanism of Tianxiangdan by Regulating Endoplasmic Reticulum Stress Through GRP78/NLRP3 Signaling Pathway

ZHANG Xiaxia， BAI Yinxue， WU Dandan， SUN Longfei， REN Shan， AN Dongqing

Xinjiang Medical University Institute of TCM， Urumqi 830011， Xinjiang， China

Corresponding Author  AN Dongqing， E-mail： 995079431@qq.com

Abstract  Objective：Based on the glucose-regulatory protein 78（GRP78）/NOD-like receptor protein 3（NLRP3） signaling pathway to explore the anti-atherosclerosis mechanism of Tianxiangdan through regulation of endoplasmic reticulum stress.Methods：A total of 35 male apolipoprotein E gene knockout（ApoE-/-） mice were randomly divided into model group，atorvastatin group and Tianxiangdan group，with 6 mice in each group.Atherosclerosis model was induced by high fat diet.Another 10 male C57BL/6J mice were selected as the normal group.After 10 weeks of modeling，the corresponding drug treatment was given.The intervention lasted for 12 weeks.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological features of thoracic aorta.Serum interleukin-1β（IL-1β），interleukin-18（IL-18） and reactive oxygen species（ROS） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The positive expression levels of GRP78 and NLRP3 proteins in thoracic aorta were detected by immunohistochemistry（IHC-P）.Results：Compared with model group，the expression levels of IL-1β，IL-18 and ROS in atorvastatin group and Tianxiangdan group decreased（P＜0.05 or P＜0.01），the positive expressions of GRP78 and NLRP3 decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Tiangdan can effectively improve the inflammatory response of mice with atherosclerotic cardiovascular disease，and its mechanism may be related to the regulation of endoplasmic reticulum stress GRP78/NLRP3 signaling pathway to inhibit the activation of inflammasome and reduce the inflammatory damage of arteriosclerotic disease.

Keywords  arteriosclerotic cardiovascular disease; Tianxiangdan; endoplasmic reticulum stress; glucose-regulatory protein 78; NOD-like receptor protein 3; experimental study

基金项目  国家自然科学基金项目（No.8206150791）；新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题（No.2023D04052）；新疆维吾尔自治区研究生创新项目（No.XJ2023G198）；新疆维吾尔自治区重点实验室项目（No.2020D04006）；新疆维吾尔自治区重大科技专项（No.2022A03019）

通讯作者  安冬青，E-mail：995079431@qq.com

引用信息  张夏夏，白银雪，吴丹丹，等.天香丹通过GRP78/NLRP3信号通路调控内质网应激抗动脉粥样硬化的作用机制研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（11）：1955-1960.

动脉粥样硬化性心血管疾病（arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）是全球死亡的主要原因之一［1］，其中血脂异常是关键的致病因素。据《中国心血管健康与疾病报告2022概要》［2］报道，在我国因ASCVD导致的死亡人数高达1 139万例，其不适症状的延绵性、长期性和医疗昂贵等方面，已成为全球亟待解决的社会和医学问题。

动脉粥样硬化的发病机制已被广泛研究，其中炎症反应被认为贯穿于其整个发病过程，由此，抑制炎症反应也被称为“曙光初现”［3］。目前，常规治疗动脉粥样硬化的方法包括调节血脂、抗炎、扩血管、抗凝等药物，病变管腔发生明显狭窄或堵塞时，以介入或手术治疗为主。然而长期联合服用以上药物多伴有肌溶解和肝损伤等副作，目前医学影像技术也具有一定局限性，并且介入手术易影响血管阻力指数导致肌细胞死亡［4-6］。然而，在我国，中医药治疗动脉粥样硬化疗效显着且副作用较小［7-14］。复方天香丹已取得临床成果转化与专利申请，本方由红景天、丹参、新塔花、降香组成，全方共奏行气活血、化瘀止痛之功，经长期临床研究发现，天香丹具有抗动脉粥样硬化的疗效［15］。

研究者发现，随着对动脉粥样硬化机制的深入研究，炎症反应与内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）之间的串扰机制可能是揭示动脉粥样硬化发病机制的新途径。ERS标志物葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）已在多种心血管疾病中表达，其介导的炎症反应和细胞凋亡与动脉粥样硬化的形成和斑块的脱落密切相关［16-21］。ERS发生时，解离后的GRP78能够介导多种下游信号通路激活炎症小体（nod-likereceptorprotein 3，NLRP3）加重动脉粥样硬化的进展［22-23］。前期研究中发现，NLRP3可能是天香丹治疗动脉粥样硬化的关键靶标［24-25］。但ERS是如何通过调控激活NLRP3介导天香丹发挥其心肌保护作用的机制未明确。由此，本研究拟在成功干预动脉粥样硬化动物模型的基础上，探讨天香丹通过GRP78/NLRP3信号通路调控ERS抗动脉粥样硬化的作用机制，为天香丹防治动脉粥样硬化提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  药物与试剂

天香丹颗粒购自新奇康药业股份有限公司（规格：每包9 g，批号：210540，药物专利号：200910210063.9）；阿托伐他汀钙片购自辉瑞制药有限公司（批号：EE0898）。白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）、活性氧（ROS）酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒均购自上海优选生物科技有限公司（批号：YX-E28912、YX-E21218、YX-E28857）；苏木精-伊红（HE）染色液购自北京兰杰柯科技有限公司（批号：BL700B）；兔超敏二步法免疫组化检测试剂、封闭用羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司（批号：PV-6001、ZLI-9022）；3，3′-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、抗体GRP78、NLRP3购自艾博抗贸易有限公司（批号：ab64238、ab21685、ab214185）；通用型抗体稀释液购自北京索莱宝科技有限公司（批号：A1800）。

1.2  仪器

低温高速离心机、全自动组织脱水机、EG1150型包埋机、RM2235型切片机、恒温水浴锅均购自德国Leica；自动恒温烤片仪（湖北泰雅医疗科技），恒温干燥箱（上海博讯），酶标仪（美国Thermo Fisher），正置光学显微镜（日本Nikon）。

1.3  实验动物

43只无特定病原体（SPF）级雄性8周龄小鼠，其中载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠33只，C57BL/6J小鼠10只，体质量（18±2）g，购于北京维通利华实验动物科技有限公司和新疆医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（京）2021-0006。饲养环境于人工昼夜循环空气清洁房内，温度为22～28 ℃，明暗时间为12 h/12 h，自由饮水、进食。适应性喂养1周后开始实验。实验动物经新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会审批（批号：IACUC-20200331-47）。

1.4  造模、分组及给药方法

检疫适应1周后，将33只8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为模型组（高脂饲料＋纯化水）、阿托伐他汀组（高脂饲料＋阿托伐他汀钙片冲泡液）、天香丹组（高脂饲料＋天香丹颗粒冲泡液），每组11只，予高脂饲料（含21%脂肪、0.15%胆固醇）喂养；10只C57BL/6J小鼠作为正常组，予以基础饲料喂养（基础饲料＋蒸馏水）。饲养第11周，随机处理3只ApoE-/-小鼠检验斑块形成后，给予药物灌胃干预。药物以成人临床用药剂量同效换算小鼠实验用药量灌胃，将干预药品溶于500 μL纯化水中，阿托伐他汀组与天香丹组分别按照3.0 mg/（kg·d）、2.7 g/（kg·d）的剂量进行治疗，模型组和正常组以同比例体积的纯化水进行灌胃，每日1次，每周根据小鼠体重变化调整药物灌胃量，继续喂养12周。造模及给药期间各组均有死亡，最终统计样本量各为6只。

1.5  标本留取

末次灌胃后，术前12 h禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液麻醉，触及心尖搏动最强处后进行胸腹部区域消毒，沿膈肌下缘剖开腹腔，取1 mL注射器与心尖搏动处呈30°角刺入5～10 mm处采集血液后取上清，置于－80 ℃低温保存用于检测血清指标。后剥离颈、胸、腹主动脉组织分装于4%多聚甲醛固定液中，用于HE、免疫组织化学法（IHC-P）病理观察。

1.6  IL-18、IL-1β、ROS水平检测

按照ELISA试剂盒说明书，采用双抗夹心法检测各组血清IL-18、IL-1β、ROS水平。

1.7  IHC-P法检测胸主动脉组织中GRP78、NLRP3蛋白表达量

切片放入60 ℃烘箱中1 h后置于室温10 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中浸泡20 min，各梯度乙醇中浸泡5 min，高温抗原修复20 min，放置室温1 h，滴加H2O2酶遮光放置15 min，滴加山羊血清并放入37 ℃烘箱孵育30 min，滴加一抗于4 ℃冰箱过夜，复温30 min，滴加二抗并放入37 ℃烘箱孵育30 min，DAB、苏木精染液染色后进行分化与脱水处理，二甲苯溶液透明并封片，镜下采集图像并分析蛋白表达量。

1.8  统计学处理

运用SPSS 27.0统计软件对数据进行处理分析。定量资料满足正态分布用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结  果

2.1  各组小鼠胸主动脉组织HE染色结果

HE染色结果显示，模型组可见明显斑块，阿托伐他汀组与天香丹组斑块较模型组减小，正常组无斑块出现。详见图1。

2.2  各组血清IL-1β、IL-18、ROS水平比较

与正常组比较，模型组小鼠血清IL-1β、IL-18、ROS水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组与天香丹组血清IL-1β、IL-18、ROS水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。详见图2。

（A为各组IL-1β水平比较；B为各组IL-18水平比较；C为各组ROS表达比较）

2.3  各组胸主动脉中GRP78、NLRP3蛋白阳性表达比较

与正常组比较，模型组GRP78、NLRP3蛋白阳性表达明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组与天香丹组GRP78、NLRP3蛋白阳性表达明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。详见图3、图4、表1。

3  讨  论

动脉粥样硬化的发生与发展可引起心肌梗死、心肌纤维化等急性临床事件［26］，是导致病人死亡的重要危险因素。动脉粥样硬化本质是一类慢性炎症性疾病，血管内膜中沉积的不溶性胆固醇晶体常积累在溶酶体中并破坏其膜结构，溶酶体裂解后释放的组织蛋白酶可促进NLRP3炎症小体活化、激活NLRP3蛋白，启动下游炎性因子IL-1β、IL-18持续加重炎症反应，促使坏死核心形成和纤维帽变薄，最终导致斑块破裂和血栓形成，引起急性血管性病变［27］。因此，靶向抑制NLRP3炎症小体是治疗动脉粥样硬化的关键一环。

自炎症小体首次发现以来，有关NLRP3炎症小体参与动脉粥样硬化性疾病的研究较多，目前动脉粥样硬化中NLRP3炎症小体活化的学说包含氧化应激、线粒体功能障碍、ERS、溶酶体破裂等，其中包含多类别、多形式的分子信号传递，如K＋、Ca2＋的流离，三磷酸腺苷（ATP）、ROS及蛋白分子的释放［28-30］。ERS介导动脉粥样硬化发病的多种病理过程中涉及多条信号通路，ERS水平持续升高会激活NLRP3炎症小体，本研究在上述作用机制的基础上进一步探索ERS与NLRP3炎症小体及信号蛋白在动脉粥样硬化中的交互作用。ERS是内质网在受刺激后引起自身对蛋白产生错误折叠与未折叠蛋白积累的一种反应［31］，在不同物种的动脉粥样硬化病变处已经发现ERS标志物［32］。相关研究证实除ERS抑制剂外，相关拮抗药物也能在动脉粥样硬化模型或环境下下调GRP78、NLRP3、IL-18、IL-1β、ROS的表达，其中中药丹参提取物丹参酸B在GRP78-NLRP3信号传递过程中体现出良好的调控效果［33-37］，以上研究结果与本实验结果相符。近年来，国内外对ERS参与动脉粥样硬化的查究进展持续加快，但少有研究探索动脉粥样硬化性疾病中ERS与NLRP3的交互影响及作用。中医药对动脉粥样硬化的防治颇有研究且安全效优，本研究为中医药调节ERS抑制NLRP3炎症小体活化治疗动脉粥样硬化提供理论依据。

中医治疗动脉粥样硬化主要采用化痰、祛瘀、活血、行气等，并将动脉粥样硬化归属于“真心痛”“胸痹”等范畴。痰涎本由气血化生，虚留于脉且久息成积则会导致气虚不推血运形成瘀血，血虚不流则脉道不通，痰饮久而不去则血易成浊，壅于血府，血瘀自成。本虚是动脉粥样硬化发病的前提，脉中无气、血府积浊导致的“痰瘀”阻塞是脉痹发生与发展的关键，痰瘀互结、损伤脉道是动脉粥样硬化发病的病机［38］，其中不通则痛的表现最为常见，痰瘀同治与补益并施是动脉粥样硬化的治疗原则。内质网于稳态下的作用与气血的功能极其相似，气血功能的失调与ERS相关，部分学者认为内质网的功能结构与三焦也有相似之处，气血的疏通和气机的调畅也与内质网有一定联系［39-41］。研究发现，中药单体、中药提取物、中成药、中药复方能在动脉粥样硬化中对ERS起到调控作用［42］。复方天香丹以红景天为君，具有补气养血、活血化瘀止血之功；丹参为臣，具有益气养血、活血通络、祛瘀止痛之功效；新塔花与降香俱为辛香走窜之品，有通阳宣痹作用，全方遵循“本虚标实”的病机，以通而不忘其正虚、补而不忘其邪实的疗法达到治疗目的。前期临床及基础研究证实，天香丹能够通过降低血清中炎性因子及血脂水平、稳定斑块、改善血管内皮功能等方面达到治疗动脉粥样硬化的作用，其中涉及血流动力学、核因子-κB信号通路、基因组学、细胞凋亡、脂质代谢等研究，然而对ERS学说的探索较少［43-49］。本实验结果显示，与模型组相比，天香丹能够通过减轻ERS，在动脉粥样硬化模型小鼠胸主动脉和血清中下调ERS起始蛋白GRP78及炎症蛋白NLRP3、IL-18、IL-1β和促炎物质ROS的表达量。

综上所述，复方天香丹可能通过调控GRP78/NLRP3信号通路降低GRP78、NLRP3蛋白和ROS的表达，减少下游炎性因子IL-18、IL-1β的释放，缓解ERS并抑制炎症反应进程，达到减缓动脉粥样硬化发生发展和抗动脉粥样硬化的作用。中医药调控ERS抑制NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化的作用机制，不仅能够加深对动脉粥样硬化起病机制的理解，也可为动脉粥样硬化的诊断提供新方向。

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（收稿日期：2024-01-21）

（本文编辑郭怀印）