紫杉醇对绒癌JEG-3细胞增殖与凋亡的影响

李 岑，刘惠宁

（1.江苏省扬州市第一人民医院妇产科，江苏 扬州 225000；2.中南大学附属湘雅医院妇科，湖南 长沙 410000）

紫杉醇对绒癌JEG-3细胞增殖与凋亡的影响

李 岑1，2，刘惠宁2

（1.江苏省扬州市第一人民医院妇产科，江苏 扬州 225000；2.中南大学附属湘雅医院妇科，湖南 长沙 410000）

目的 该文围绕紫杉醇对人绒毛膜癌细胞 JEG-3的增殖与凋亡的影响进行研究。方法 通过 MTT法检测细胞增殖及流式细胞术检测不同浓度紫杉醇作用下细胞的凋亡及其对细胞周期的影响。结果 随紫杉醇浓度的增加或时间的延长，JEG-3细胞增殖抑制率及凋亡率均增大，各组间比较有统计学意义（P＜0.05）。结论 该次实验的结果显示紫杉醇在抑制绒癌细胞 JEG-3增殖及促凋亡方面均有显着的作用。

紫杉醇；JEG-3细胞；增殖；凋亡

绒毛膜癌（choriocarcinoma，CC）是一种继发于妊娠之后的滋养细胞肿瘤。取代以滋养细胞形成绒毛或水泡状结构，绒癌细胞呈片状高度增生，并广泛侵入子宫肌层，破坏子宫肌层内血管，一方面造成组织缺血坏死，另一方面通过侵蚀血管，绒癌细胞随血液转移至肺、阴道等处并在转移部位继续侵蚀血管造成局部出血。区别于其他妇科恶性肿瘤，化疗药对绒癌的治疗效果极好，FIGO评分低危的患者基本可全部治愈，高危患者治疗失败率也仅15%左右［1］。目前国内常用的化疗药物有甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶（5-FU）等，其毒副作用较大，呕吐等化疗副反应常导致患者无法坚持全疗程化疗，且耐药问题逐渐明显［2］，故寻找新的、有效的、低毒反应的治疗绒癌药物的需求逐渐迫切。紫杉烷类药物是一种三环二萜化合物［3］，起初由Wani等从短叶红豆杉的树皮中分离出天然紫杉醇［4］，随后，由法国罗纳普朗克·乐安公司经半合成浆果紫杉针叶中的提取物得到多西紫杉醇即半合成紫杉醇。最初，Harwitz等于20世纪70年代末初步揭示了紫杉醇独特的抗肿瘤机制，此后，各国研究人员相继证明了其在治疗卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、食管癌、乳腺癌及直肠癌等多种癌症中的明确作用［5-6］及其作用机制［7］，这些研究结果被应用于临床，目前紫杉醇已成为晚期乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌等治疗的一线药物。本研究的目的是通过研究紫杉醇影响绒癌 JEG-3细胞的增殖能力与诱导凋亡情况，为应用紫杉醇治疗绒癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株来源 人绒毛膜癌细胞系 JEG-3为北京中国科学院动物研究所“计划生育及生殖生物学国家重点实验室”购得后于湘雅医院中心实验室传代保存。

1.1.2 主要试剂 多西紫杉醇自江苏恒瑞医药股份有限公司购买；胎牛血清、RMPI-1640由湘雅医院中心实验室提供；胰蛋白酶购买于美国 Sigma公司。

1.2 绒癌细胞株 JEG-3细胞培养 在含有15%胎牛血清-RPMI1640培养液中贴壁培养JEG-3细胞。环境温度37℃，CO2浓度5%，饱和湿度。隔天更换培养液一次。细胞覆盖率达到 70%～80%时消化传代，用对数生长期的细胞进行实验。

1.3 方法

1.3.1 MTT法检测多西紫杉醇对 JEG-3细胞增殖的影响 实验分组：根据作用于细胞的多西紫杉醇浓度不同将实验分为7组，样本数 4个（浓度分组：0.0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 mg·L-1）。药物作用时间分别为 24、48、72 h；实验方法：制备单细胞悬液→96孔板内培养至贴壁生长→根据分组加入药物溶液→继续培养 24、48、72 h→MTT法测定细胞增殖抑制率。

1.3.2 流式细胞仪检测多西紫杉醇对绒癌 JEG-3细胞凋亡及细胞周期的影响 实验分组：根据作用于细胞的多西紫杉醇浓度不同将实验分为 4组。样本数4个（浓度分组：0.0、0.001、0.01、0.1 mg· L-1）。药物作用时间分别为：24、48 h；实验方法：制备单细胞悬液→培养瓶内培养至贴壁生长→根据分组加入药物溶液→继续培养 24、48 h→将培养瓶内细胞制备成单细胞悬液并固定细胞→细胞凋亡及细胞周期情况检测（由流式细胞仪完成）。

1.4 数据整理与统计学分析 数据经 SPSS15.0统计软件统计分析，组内数据行正态分布性检验，组间数据经方差齐性检验后行方差分析；Spearman分析各变量之间的相关性；IC50用probit回归分析计算，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 MTT法检测 JEG-3细胞增殖抑制率 见表1。用不同浓度多西紫杉醇处理 JEG-3细胞 24、48 和72 h后的细胞增殖抑制率。各多西紫杉醇作用组细胞增殖抑制率与空白对照组比较（P＜0.05，有统计学意义）。同一浓度多西紫杉醇作用下，时间延长与细胞增殖抑制率与同一作用时间下，多西紫杉醇浓度增加与细胞增殖抑制率均呈直线相关（P ＜0.05，有统计学意义），相关系数 r＞0.8，P＜0.05。多西紫杉醇作用 24、48、72 h的IC50分别为99.6、4.1、0.1 mg·L-1。

2.2 流式细胞仪检测绒癌 JEG-3细胞凋亡率和细胞周期

2.2.1 细胞凋亡率的统计 根据流式细胞仪检测结果分析：用呈 10倍增加浓度的多西紫杉醇处理JEG-3细胞24和48 h后的细胞凋亡率（表 2）。各多西紫杉醇作用组细胞凋亡率均大于空白对照组，且细胞凋亡率随多西紫杉醇作用浓度的增加和作用时间的延长而增大（P＜0.05，有统计学意义）。凋亡曲线图显示凋亡峰于G1期前出现（图1，2）。

表1 不同浓度多西紫杉醇作用24、48、72 h后的 JEG-3细胞增殖抑制率%［（±s），n＝4］

表1 不同浓度多西紫杉醇作用24、48、72 h后的 JEG-3细胞增殖抑制率%［（±s），n＝4］

注：按a＝0.05水准，同一浓度不同时间组及同一时间不同浓度组与对照组增殖抑制率比较（P＜0.05，具有统计学意义）。

多西紫杉醇浓度／mg·L-1作用时间／h 24 48 72 0.0 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.001 11.43±0.27 14.21±0.24 20.89±0.25 0.01 14.95±0.33 25.99±0.74 34.04±0.26 0.1 19.05±0.34 34.03±0.66 49.98±0.43 1 31.79±0.45 45.23±0.27 67.03±0.31 10 39.54±0.47 63.27±0.28 81.53±0.28 100 52.33±0.62 84.57±0.56 97.12±0.22

表2 不同浓度多西紫杉醇作用24、48 h后的JEG-3细胞凋亡率%［（±s），n＝4］

表2 不同浓度多西紫杉醇作用24、48 h后的JEG-3细胞凋亡率%［（±s），n＝4］

注：按a＝0.05水准，同一浓度不同时间组及同一时间不同浓度组与对照组凋亡率比较，P＜0.05，具有统计学意义，不同时间组间及不同浓度组间两两比较，P＜0.05，具有统计学意义。

多西紫杉醇浓度／mg·L-1作用时间／h 24 48 0.0 1.35±0.32 1.36±0.35 0.001 11.02±0.22 12.48±0.33 0.01 13.94±0.26 23.46±0.46 0.1 17.01±0.48 32.03±0.29

图1 不同浓度多西紫杉醇作用24 h后 JEG-3细胞凋亡图

图2 不同浓度多西紫杉醇作用48 h后 JEG-3细胞凋亡图

2.2.2 细胞周期分析 分别用终浓度为0.001、0.01、0.1 mg·L-1的多西紫杉醇处理 JEG-3细胞24和48 h后的JEG-3细胞周期百分比（见表 3、图3，4）。不同浓度多西紫杉醇作用于JEG-3细胞后G2／M期的百分比与对照组比较均增加（P＜0.05，有统计学意义），且 G2／M期 JEG-3细胞百分率随多西紫杉醇浓度增高而递增。

表3 不同浓度多西紫杉醇处理 JEG-3细胞24和48 h后的细胞周期百分比［（±s），n＝3］

表3 不同浓度多西紫杉醇处理 JEG-3细胞24和48 h后的细胞周期百分比［（±s），n＝3］

注：按a＝0.05水准，同一时间不同浓度组G2／M期细胞百分比均大于对照组，P＜0.05，具有统计学意义。*为实验误差。

作用时间 G0／G1S G2／M

图3 不同浓度多西紫杉醇作用24 h后 JEG-3细胞周期图

图4 不同浓度多西紫杉醇作用48 h后 JEG-3细胞周期图

3 讨论

本实验经由 MTT比色法，检测出多西紫杉醇作用后，存活的绒癌 JEG-3细胞减少，存活绒癌 JEG-3细胞的百分比随药物浓度的增加及作用时间的延长而下降，呈明显时间、浓度相关，多西紫杉醇作用于 JEG-3细胞 72 h的IC50为 0.1 mg·L-1，与该类药物对其敏感的恶性肿瘤细胞的IC50相近［8］。

紫杉醇是典型的细胞毒剂，药物通过作用于细胞质中的细胞微管网，结合至微管蛋白 N端第 217 ～231位和第31位氨基酸，促进微管蛋白的聚合并抑制其解聚，使组成微观的细胞内骨架的合成停止而形成稳定的非功能性微管束，微观组织中心与非功能性微观束连接增加，与功能性维管束的相互连接被阻断，细胞有丝分裂停止于 G2／M期后死亡［9］。本实验发现多西紫杉醇作用于绒癌细胞后，JEG-3细胞的有丝分裂停止于 G2／M期，且细胞凋亡与药物具有时间—浓度依赖性，支持该种观点。另有观点认为紫杉醇还能与巨噬细胞上的肿瘤坏死因子（TNF）受体结合，使细胞释放TNF-α1、INF-α、INF-β、IL-1、IL-2、IL-6增加，而达到对肿瘤细胞抑制和杀伤的作用［10］。紫杉醇能否经此种方法诱导 JEG-3细胞凋亡，本次试验未涉及，有待进一步试验明确。

［1］ Blutt SE，Mc Donnell TJ，Polek TC，et al.Calcitriol induced apoptosis in LNCaP cells is blockde by overexpression of Bcl-2［J］.Endocrinology，2000，141（1）：10-17.

［2］ Feng SS，Mu L，Chen BH，et al.Polymeric nanospheres fabricated with natural emulsifiers for clinical administration of an anticancer drug paclitaxel（Taxol）［J］.Mater Sci Eng，2002，20（122）：85-89.

［3］ 肖崇厚.中药化学［M］.上海：上海科学技术出版社，1997：461 -463.

［4］ Wani MC，Taylor HL，Wall WE，et al.Plant antitumor agents VI：The isolation and structure of Taxol，a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia［J］.J Am Chem soc，1971，93 （9）：2325-2327.

［5］ 李世伟，季楚舒，何义富.紫杉醇方案治疗晚期食管癌的临床研究进展［J］.安徽医药，2012，16（11）：1561-1563.

［6］ 杨慧玲，李 军.多西他赛单药一线治疗晚期非小细胞肺癌临床研究［J］.实用临床医药杂志，2012，16（17）：109-111.

［7］ 余景星，刘 心，徐 波.多西他赛诱导 HL-60／ADR细胞凋亡对P-gp、BCL-2、BAX蛋白表达的影响［J］.中国实验血液学杂志，2010，18（2）：311-316.

［8］ Stierle A，Strobel G，Stierle D，et al.The search for taxol producing microorganisms among the endophytic fungi of the Pacific yew.Taxus Brevifolia［J］.J Nat Prod，1995，58：1315-1324.

［9］ Schiff PB，Fant J，Horwitz SB.Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol［J］.Nature，1979，277（5698）：665-667.

［10］Extra JM，Rousseau F，Bruno R，et al.PhaseⅠ and pharmacokinetic study of Taxotere（RP 5697；NSC 628503）give as a short intravenous infusion［J］.Cancer Res，1993，53（5）：1037-1042.

Effect of Docetaxel on the proliferation and apoptosis of choriocarcinoma JEG-3 cells

LI Cen1，2，LIU Hui-ning2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，First People’s Hospital of Yangzhou，Jiangsu 225000，China；2.Xiangya Hospital，Changsha，Hunan 410000，China）

Objective To explore the effect of Docetaxel on the proliferation and apoptosis of choriocarcinoma JEG-3 cells.Methods MTT assay was used to detect the proliferation of choriocarcinoma JEG-3 cells and flow cytometry to detect the effect of Docetaxel under different concentrations on apoptosis and cell cycle.Results With the increase of drug concentration in Docetaxel and drug action time，the degree of inhibition and apoptosis of human choriocarcinoma JEG-3 cells was significantly increased（P＜0.05）.Conclusions The experimental results show that Docetaxel has significant effect on inhibiting proliferation and promote apoptosis of choriocarcinoma JEG-3 cells.

Docetaxol；JEG-3 cells；proliferation；apoptosis

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.049

2013-12-28，

2014-03-06）