王航宇，杨文义，韩大正，魏书堂，武利萍，徐梦阳，闫春晓，谭莉霞，董勇，杨国威，华静，杜莹莹

作者单位：河南大学第一附属医院消化病联合微创病区，河南 开封 475001

溃疡性结肠炎（UC）是临床常见的慢性炎症性肠道疾病，可发于任何年龄，而相较于年轻病人，老年病人受年龄影响，身体机能降低，治疗更为棘手［1-2］。目前UC发病机制尚未明确，多数学者认为免疫系统紊乱引起的免疫炎症反应是其发病的主要因素［3-，4］。有研究表明，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6（NLRP-6）具有抑制天然免疫反应相关信号通路作用，能够促进白细胞介素-18（IL-18）及抗菌肽的分泌，参与肠黏膜屏障的损伤及修复过程，与肠道炎症性疾病的发生、发展密切相关［5-6］。而降钙素原（PCT）是细菌感染、内毒素刺激后机体大量表达的炎性介质，在肠道炎症反应中也发挥着重要作用［7］。本研究分析老年UC病人NLRP-6、PCT和IL-18表达水平，分析三者用于评估UC病情的临床意义，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019 年1 月至2020 年12 月河南大学第一附属医院收治的72例老年UC 病人。72例病人中活动期52 例（轻度18 例，中度20 例，重度14 例），缓解期20 例。活动期病人中男30 例，女22例；年龄（65.42±6.37）岁，范围为60～72 岁；病程（4.21±1.38）年，范围为1～6 年；病变部位包括直肠24 例，乙状结肠16 例，降结肠12 例。缓解期病人中男12 例，女8 例；年龄（64.87±4.96）岁，范围为60～73岁；病程（3.92±1.51）年，范围为1～6 年；病变部位包括直肠10 例，乙状结肠7 例，降结肠3 例。缓解期、活动期病人一般资料差异无统计学意义（P>0.05）。纳入标准：符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018年·北京）》［8］诊断标准；年龄≥60岁；对研究知情同意。排除标准：合并其他消化道疾病；合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病；有非甾体抗炎药、质子泵抑制剂等药物长期应用史；合并重要器官实质性疾病；酗酒；有精神疾病史。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法NLRP-6 阳性细胞蛋白的表达检验：取病人直肠或结肠黏膜切片标本，采用Eli VisionTM‑plus即用型免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺显色剂进行免疫组化染色，高倍镜下（×400）选择5个视野，采用Image-ProPlus 6.0 软件测定各视野中阳性染色区域的累积光密度值，取平均值为该黏膜组织中NLRP-6阳性细胞蛋白的表达水平。

NLRP-6、IL-18 mRNA 表达水平检测：取病人直肠或结肠黏膜切片标本，Trizol 法提取RNA，使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录反应合成cDNA，再进行实时荧光定量PCR，β-actin 为内参，以2-ΔΔCt法计算NLRP-6、IL-18 mRNA表达水平。

IL-18、PCT 检测：肠镜检查前1 d 采集病人6 mL血液标本，以酶联免疫吸附法检测IL-18 水平，以双抗夹心免疫化学发光法检测血清PCT水平。

1.3 统计学方法数据分析采用SPSS 21.0 软件。正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验；偏态分布的资料以M（P25，P75）表示，比较采用Mann-WhitneyU检验；相关性分析采用Pearson 相关分析法和Spearman 相关分析法；各检测指标均建立均绘制受试者工作特征曲线（ROC 曲线），读取最大约登指数，对应计算理论阈值和灵敏度、特异度；联合诊断ROC 曲线绘制时建立logistic 预测/诊断评估模型，依据所得回归系数B，归一化加权计算并对应处理各样本资料，由此进行联合应用的ROC 分析；P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病人NLRP-6、PCT 和IL-18 表达水平比较缓解期病人NLRP-6 基因和蛋白表达高于活动期（P<0.05），IL-18 基因表达、血清IL-18、血清PCT 水平低于活动期（P<0.05），见表1。

表1 老年UC病人72例NLRP-6、PCT和IL-18表达水平比较/±s

表1 老年UC病人72例NLRP-6、PCT和IL-18表达水平比较/±s

注：UC为溃疡性结肠炎，NLRP-6为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6，IL-18为白细胞介素-18，PCT为降钙素原。①数据中，偏态分布的资料以M（P25，P75）表示。

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2.2 不同病情活动度病人NLRP-6、PCT 和IL-18表达水平比较活动期病人NLRP-6 基因和蛋白表达比较：轻度>中度>重度（P<0.05），IL-18基因表达、血清IL-18、血清PCT 比较：重度>中度>轻度（P<0.05），见表2。

表2 老年UC病人活动期52例不同病情活动度NLRP-6、PCT、IL-18表达水平比较/±s

表2 老年UC病人活动期52例不同病情活动度NLRP-6、PCT、IL-18表达水平比较/±s

注：UC为溃疡性结肠炎，NLRP-6为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6，IL-18为白细胞介素-18，PCT为降钙素原。①数据中，偏态分布的资料以M（P25，P75）表示。

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2.3 相关性分析活动期病人NLRP-6基因表达和蛋白表达均与IL-18 基因表达、血清IL-18、血清PCT及疾病活动度负相关，IL-18 基因表达与血清IL-18、血清PCT 及疾病活动度正相关，血清IL-18 与血清PCT 及疾病活动度正相关，血清PCT 与疾病活动度正相关（均P<0.05），见表3。

表3 活动期病人NLRP-6、PCT和IL-18表达水平间的相关性及与疾病活动度的相关性

2.4 NLRP-6、PCT 和IL-18 表达水平评估UC 活动期中重度的价值经ROC 分析可知NLRP-6 基因表达、NLRP-6 蛋白表达、IL-18 基因表达、血清IL-18、血清PCT 评估UC 活动期中重度均具有较好诊断价值，AUC（95%CI）分 别 为0.92（0.82～0.98）、0.90（0.79～0.97）、0.74（0.60～0.85）、0.86（0.74～0.94）、0.98（0.90～1.00）；联合应用血清IL-18、PCT 评估UC 活动期中重度的评估价值高于各指标单独应用AUC（95%CI）为0.99（0.92～1.00）。见表4，图1。

图1 NLRP-6、PCT和IL-18表达水平评估UC活动期中重度的ROC曲线

表4 NLRP-6、PCT和IL-18表达水平评估UC病情程度

3 讨论

UC 发病机制并不十分明确，治疗方法较为局限，尤其是老年病人身体机能较差，能够准确诊断、评估病情对治疗具有重要意义［9-10］。近年研究发现，炎症小体可以识别外源性和内源性信号，调节多条信号通路的表达，促进炎症细胞因子的产生，在介导炎症损伤、自身免疫反应方面发挥着重要作用，能够影响肠道炎症的发生、发展，各类炎症小体及其调控的相关因子或可成为UC 诊断、病情评估的新生物标志物［11］。

NLRP-6 是能抑制天然免疫反应相关信号通路的NLRs 蛋白家族成员，可促进半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的激活，进而激活促炎性因子IL-18 前体，激活的前体切割为成熟的IL-18 细胞因子释放到胞外参与炎症反应和免疫应答，参与UC 免疫系统紊乱和肠道发生慢性、反复性炎症反应过程［12-13］。细胞因子IL-18 在炎症和体内平衡中发挥双重作用，参与多种免疫性疾病的发生，部分研究证实，IL-18 的异常表达与UC 的发生、发展密切相关［14］。目前关于NLRP6、IL-18在肠道炎症性疾病中的作用机制已受到临床关注，但现有研究多为动物实验，相关人体的研究较少，仍需临床进行深入研究。除NLRP6、IL-18 外，PCT 是目前临床中常用的炎症标志物，与自身免疫性疾病及慢性炎症性疾病病情进展密切相关，在感染、炎症性疾病的发生、预测和诊治过程中应用广泛，但在UC 诊治中的应用报道较少［15］。基于此，本研究分析老年UC 病人NLRP6、IL-18、PCT的表达水平，结果显示，相较于缓解期，活动期病人处于NLRP-6基因和蛋白低表达而IL-18基因表达、血清IL-18、血清PCT高表达状态，且随着疾病活动程度的加重，NLRP-6基因和蛋白降低，IL-18基因表达、血清IL-18、血清PCT表达增加，说明UC发生后NLRP-6基因和蛋白低表达，IL-18基因表达、血清IL-18、血清PCT 高表达，与动物实验［16-17］结果一致。可能的机制为：UC 发病后NLRP-6 与caspase-1 和含胱天蛋白酶募集结构域（CARD 结构域）的凋亡相关颗粒样蛋白结合，其在机体促进IL-18 的成熟及分泌，IL-18 通过诱导和激活免疫细胞、诱导促炎性细胞因子、趋化因子和生长因子的产生，参与上皮修复和愈合过程，使得UC病人NLRP-6表达下调而IL-18 表达上调，NLRP-6 在UC 发病过程中可能发挥了保护性作用［18-19］；同时UC 病人机体发生的一系列免疫应答、炎症反应使血清PCT 表达上调，因此，NL‑RP-6、IL-18、PCT 均参与UC 病情加重的免疫炎症过程。相关性分析显示，活动期病人NLRP-6 基因和蛋白表达、IL-18 基因表达、血清IL-18、血清PCT 表达间均存在相关性，且NLRP-6 基因表达和蛋白表达与疾病活动度负相关，IL-18 基因表达、血清IL-18、血清PCT表达与疾病活动度正相关，提示NLRP-6、IL-18、PCT 表达是相互影响的，NLRP-6 基因和蛋白的低表达一定程度上导致了IL-18 和PCT 的高表达，三者均参与UC 病情进展。此外，本研究中ROC曲线结果显示，NLRP-6 基因表达、NLRP-6 蛋白表达、IL-18 基因表达、血清IL-18、血清PCT 均作为评估UC 活动期中重度的指标，诊断效能较好，表明临床检测UC 病人NLRP-6、IL-18、PCT 表达水平具有指导意义。考虑到临床实际中检测基因、蛋白表达相较于血清生化检测更为复测，本研究还分析了血清IL-18 联合PCT 评估UC 活动期中重度的效能，评估价值优于单一指标检测，具有较高临床价值。

综上所述，老年UC 病人NLRP-6、PCT 和IL-18表达均与疾病活动度有关，检测三者水平用于指导疾病活动度的评估。但本研究纳入样本量较少，且未能判断检测指标判断疾病痊愈的价值，有待在后续研究中加以改进。