刘家旭 汪志勇 综述 刘家宇 审校
(1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550025；2.重庆医科大学，重庆 400016)
碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，细菌对该类药物不存在交叉耐药性，因而对革兰氏阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有强大的抗菌活性[1]。国内已经上市的品种有亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南及多尼培南等，该类药物已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。然而由于目前临床上对于碳青霉烯类抗生素的过度依赖，世界各地相继出现多种耐碳青霉烯类耐药菌的报道，对于临床治疗带来了很大挑战，本文从耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的耐药机制及临床流行感染高危因素进行综述。
1 碳青霉烯类抗生素的分子结构及作用机制
碳青霉烯类抗生素其分子结构与青霉素类的青霉环相似，不同之处在于噻唑环上的硫原子为碳，且C2与C3之间存在不饱和双键，另外，其6位羟乙基侧链为反式构象。研究[2]证明，正是这个构型特殊的基团，使该类化合物与通常青霉烯的顺式构象显着不同，具有超广谱的、极强的抗菌活性，以及对β-内酰胺酶高度的稳定性。碳青霉烯类抗生素作用方式都是抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)，从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀致使细菌胞浆渗透压改变和细胞溶解而杀灭细菌。近十多年来已证实细菌胞浆膜上特殊蛋白PBPs是此药的作用靶位，比如亚胺培南与PBP的结合，尤其是PBP2的亲和力很强，阻碍细胞壁的合成，可使细菌迅速肿胀、溶解。美罗培南能迅速渗透入肠杆菌科和铜绿假单孢菌靶位，主要是与PBP2和PBP3紧密结合。帕尼培南对金葡菌的作用靶位PBP1和PBP3，对大肠杆菌、粘质沙霉菌和铜绿假单孢菌作用靶位为PBP2[3]。
2 CRE主要耐药机制
2.1产碳青霉烯酶 肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药最主要的机制就是产生碳青霉烯酶水解碳青霉烯类抗菌药物。目前人类已经发现了碳青霉烯类酶共A、B、D三类酶，其中 A、D类为非金属碳青霉烯酶，B类为金属碳青霉烯酶[4]。临床上分离的、最常见的A 类碳青霉烯酶基因型包括blaKPC、blaSME和blaGES，其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(klebsiellapneumoniae-carbapenemase，KPC)占大多数[5]，常见流行的基因型为blaKPC-2，blaKPC-2基因型在临床上的分离率最高。B类碳青霉烯酶是金属酶类的β-内酰胺酶，是研究最多的碳青霉烯酶，所包含的产酶基因型为blaNDM，blaIMP，blaVIM三类，B类碳青霉烯酶对碳青霉烯酶的水解活力高于其他广谱β-内酰胺类抗菌药物。D类碳青霉烯酶由blaOXA 等位基因编码，该酶主要存在于鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中[6]，在肠杆菌中也有一定分布但分布率较低，最常见的为blaOXA-48类耐药基因型，其临床分离率在blaOXA家族中最高[7]。
2.2外膜孔蛋白缺失 膜孔蛋白是存在于细菌质膜外膜、线粒体外膜上的通道蛋白，它们允许较大的分子(如蛋白质、rRNA)通过，膜孔蛋白是膜整合蛋白，它的膜脂结合区与其他的跨膜蛋白不同，不是α螺旋，而是β折叠。革兰阴性菌被一层具有通透性的外膜包绕着，外膜约60%的表面覆盖膜孔蛋白，聚合起来形成孔道。膜孔蛋白是跨膜蛋白通过重组形成的充满水分的孔道，常以同三聚体的形式存在，允许亲水性物质包括大多数抗生素跨膜扩散。膜孔蛋白主要有五种:OmpF、OmpC、PhoE、LamB和蛋白K。大多数β-内酰胺类抗生素可通过的膜孔蛋白为OmpF和OmpC，其特点为对带有负电荷的物质通透性明显降低。而正电荷则可促进溶质通过。OmpF的通透性较OmpC高10倍[8]。膜孔蛋白的变异可引起细菌对抗生素敏感性的下降。碳青霉烯类抗生素分子是较大的分子，革兰氏阴性杆菌外膜孔蛋白只允许较大的分子进入细菌。当细菌外膜孔蛋白缺失或减少时，进入细菌的抗生素分子的量减少，并且不产生抗生素效应，从而导致细菌产生耐药性[9]。有研究[10]提出在肺炎克雷伯菌中，OmpK35是β-内酰胺类的重要膜孔蛋白。
2.3菌体主动外排泵表达 外排泵是细菌细胞膜上的一种蛋白质。细菌菌体的细胞主动外排泵系统是形成多重耐药性的生物学基础。抗性机制的原因是外排泵的过度表达，并且抗菌药物及其代谢物被选择性地或非选择性地从细菌中泵出。肠杆菌科细菌外排泵过度表达的结果就会使敏感类细菌转化发展成多重耐药细菌，敏感菌发展为耐药菌的第一步就是外排泵的过度表达；研究[11]表明，鲍曼不动杆菌的RND家族即抗药小结分裂区(resistance nodulation division，RND)家族是不动杆菌属细菌最主要也是最早发现的外排泵系统，由于其外排底物的广泛性，外排泵的过度表达可使更多的抗菌药物被排出菌体外，从而引起多重耐药外排泵。
2.4细菌生物膜系统 细菌生物膜(BF)是由细菌吸附在生物材料和体腔中以适应生活环境而形成的一层蛋白基质混合膜。主要成分是菌体自我分泌的脂蛋白、纤维蛋白和多糖基质，主要是相同的粘液状非均相聚合物基质。法国诺曼底大学的研究[12-13]报道分析了动态条件下鲍曼不动杆菌的生物膜系统的形成，并测试了抗生素的活性，对鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌以及阴沟杆菌等生物膜系统的耐药机制进行了介绍，生物膜的主要作用是产生生物屏障作用，以降低抗生素的渗透性，抵抗抗菌药物进入细胞，并引起抗性。
3 流行高危因素
3.1传播途径 CRE的耐药性和毒力因子在病区内主要通过质粒传播，在亚洲一些卫生设施条件较差的国家CRE除了遵循医院获得性病原体的传播模式外，还通过粪—口途径传播、水传播和食源性传播。韩国的一条城镇河流[14]和印度的饮用水、地下水以及越南的地下水[15]中都有检出CRE。我国有研究[16]报道在某些医院污水中检出CRE，这充分表明了CRE的入水传播性质，提醒在CRE防控时还应做相关水源的监测。食源性传播最近在印度则被报道，研究人员从海鲜中分离出了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌[17]；肠杆菌科细菌的传播方式在院内感染传播是主要获得性传播方式，其中ICU病区中CRE的感染主要在于病原体通过患者的定植或者偶发感染，并在不同医疗机构之间通过患者流动导致传播。比如从门诊流入普通病房，再由普通病房流入重症监护病房，由院区流行形成区域爆发。
3.2感染因素
3.2.1重症监护病房(important care unit，ICU)是CRE感染的高风险病区 外文文献报道，美国部分地区的三级重症专科医院重症监护病房的CRE感染率范围处于1.5%～8.7%之间，而非CRE感染率在0.9%～4.9%，二者存在明显差异。同时据资料分析发现，机械通气、肺部疾病、抗菌药物治疗及CRE定植压力均是CRE 感染的影响因素，其中CRE定植压力指病房里CRE定植率，定植率每增加1%，感染CRE的风险增加15%，所以主动监测CRE定植压力十分必要[18]。美国北卡罗莱纳州的一家长期监护病房患者长期卧床引发CRE感染并引起了整个社区的爆发，长期卧床患者是感染高危因素之一。侵入性导管因素在呼吸重症病房所导致CRE感染发生率最高，这与呼吸重症病房患者呼吸类疾病如重症肺炎，呼吸衰竭，呼吸窘迫综合征等严重程度，气管插管开放性嵌入有很大关系[19]。重症监护病房是CRE的高危区域，重症疾病状态、长时间住院、长时间的抗菌药物使用(特别是碳青霉烯类)、侵入性医疗操作(侵入性内镜、手术、各种穿刺操作等)、人工材料置入、CRE定植压力是比较明确的风险因素。
3.2.2易感人群分类 我国三级甲等综合医院回顾性分析患者的临床资料发现新生儿及儿童，入住ICU的重症患者，肿瘤和器官移植患者，老年患者以及患有严重消化系统疾病和糖尿病的患者等免疫力低下群体是CRE感染的易感高危人群。(1)新生儿和儿童患者：免疫功能低下的新生儿和儿童患者最易受CRE的感染；一些研究[20-21]对河南省儿童医院新生儿重症监护室肺炎克雷伯菌分布和耐药性做出了分析，其中耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌分离率达到41.2%，CRE对头孢菌素类药物的耐药率普遍已达 100%。新生儿及儿童患者多器官尚未发育成熟而免疫功能低下，当存在严重疾病、免疫缺陷、长期住院(尤其入住 NICU)、侵袭性诊疗操作以及广谱抗菌药物的应用时，CRE在该群体流行播散情况不容乐观。(2)入住ICU的重症患者：入住ICU的重症患者人群因重症疾病状态，接受治疗手段以及ICU复杂环境，是被CRE感染的主要人群；北京大学人民医院陈美恋通过对2016～2017年入住外科ICU、急诊ICU和呼吸ICU的重症患者建立主动筛查组和未主动筛查组，对各部位拭子标本(直肠拭子、咽拭子、腋下拭子、鼻拭子)进行主动筛查。该研究中CRE主动筛查率为68.23%，患者主动筛查CRE的定植率4.22%，分离菌以 CRKP(耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌)为主，得出了重症ICU患者人群易感的结论[22]。由于ICU复杂的环境，若医务人员未能将病区感染加以正确预防控制，CRE很容易通过重症患者的消化系统，血液系统途径进行侵袭感染。(3)其它免疫力低下人群：免疫力低下被明确为感染CRE的重要因素之一，通常临床科室中造成免疫力低下的原因还包括肿瘤患者放化疗，实体器官和干细胞移植患者术后使用免疫抑制剂，年龄>70岁老年患者的免疫功能退化，消化系统严重疾病导致肠道菌群失调以及糖尿病患者合并并发症感染等。类似于这类患者也是感染易发人群，其中肿瘤科和干细胞移植中心等区域有相关流行报道[23-24]。
3.2.3CRE检出来源 在张艳君等[25]的研究中，2013～2014年上海长海医院所分离的CRE主要分离自呼吸道，占33.6%，其次为其他无菌体液和分泌物，分别占16.0%和15.7%。冯旭慧的研究[26]显示，浙江余姚第四人民医院2012～2014两年间所有检出CRE菌株66株标本中，痰液检出占74.2%，其次是渗出物占16.7%，血液占4.5%，尿液占3.0%，胆汁占1.5%。呼吸道标本主要为痰、肺泡灌洗液、支气管灌洗液，由此可见呼吸道标本的高分离率与呼吸内科ICU的高CRE检出率呈现良好对应关系，临床常见耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)主要分离自痰液。国外的研究[27]几年前将直肠拭子主动筛查CRE纳入研究范围，发现直肠中CRE定植率较高，直肠拭子目前在国内正逐渐提上研究日程。
3.2.4分离病原菌及主要耐药基因型别 近年来CRE对碳青霉烯类药物的耐药率不断增加，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的检出种类，检出数量也随之增长。中国CRE监测网一项多中心联合研究[28]覆盖中国大陆14个省的25家三级甲等医院发现，在664例CRE病例中，分离病原菌大多数为肺炎克雷伯菌(73.9%)，其次是大肠埃希菌(16.6%)和阴沟肠杆菌(7.1%)，肺炎克雷伯菌在临床上分离率最高，传播也最广。同时显示CRE感染发生率为每10 000人中有4人感染，地区差异显着，其中感染发生最高在江苏(14.97/10 000)，最低在青海(0.34/10 000)，不同地区的人口密度与CRE的感染率可能呈现一定关系。CRE的产酶耐药基因型别有五类，分别为blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA及blaNDM，当下研究最多的产酶基因型别鉴定技术Gene Xpert以及常规PCR方法能鉴定到亚基因型，分离最多的耐药亚基因型别为blaKPC-2和blaNDM-1，二者在国外的GeneXpert方法学验证报道中被经常提及[27,29]。
4 总 结
美国传染病中心 (communicable disease center,CDC)在2015年再次修订CRE防控指南，指出美国近50%的医院患者因为CRE感染而死亡，CRE已经被美国欧洲列为严重紧迫的公共健康威胁，并建议对高危人群进行主动筛查。产碳青霉烯酶，外膜孔蛋白缺失，菌体主动外排泵表达和细菌生物膜系统是导致细菌耐药的主要四类原因。这可能是单个耐药机制的结果，也可能是联合耐药机制的结果。临床上所分离的CRE中,产碳青霉烯酶为CRE的主要耐药机制，也是当下的研究热点，为减少耐碳青霉烯酶类细菌的产生，临床医生应谨慎、合理地选择性使用碳青霉烯类抗菌药物，严格根据患者适应证选用药物。我国仍存在医疗资源分布不均，医院水平参差不齐，基础卫生设备较差的问题。CRE的耐药性和毒力因子在病区内主要通过质粒传播，在防止传播过程中人群应注意水卫生，食物环境卫生以及接触卫生，医务工作者的工作重点在于手卫生、环境的消毒灭菌、接触隔离措施、对感染和定植患者的密切监测、抗菌药物合理管理、卫生人员的教育和培训等方面。特别在ICU病区，CRE的感染发生率明显高于普通病区，这与ICU病区患者的重症疾病状态、长的住院时间、多次抗菌药物使用(特别是碳青霉烯类)、侵入性医疗操作等具有显着关系，ICU病区是我们应关注的重点。分离的病原菌中大部分标本来源于呼吸道，痰液是主要分离来源标本，重症肺炎，呼吸衰竭类患者最常见，这提示医院呼吸病区尤其是呼吸内科ICU为感染重灾区，常态化的CRE检测和主动干预应提上该病区工作日程。2006年以色列出现过全国范围内的CRE疫情爆发，以色列国家卫生部门通过合理制定防控治疗策略成功控制该次疫情[30]，我国CRE的感染率近年来不断增高，新型突变的耐药菌株也偶有报道，形势不容乐观。国家和地区卫生部门层面应统一协调各级医院制定防控策略，可分区划分重点控制区域，成立逐级防控网和监测网。医院更应该将防控培训教育从主管医生落实到管床护士，清洁护工，直至患者，建立完善的控制链。分析CRE根本的耐药机制可为临床合理利用药物和新药设计开发提供参考，分析其流行高危因素以多方面提高防控策略，CRE防控必将取得根本性进步和发展。
