黄 菲，陈 菲，陈良龙

（1.赣南医学院科研中心；2.赣南医学院2015级临床医学本科生，江西 赣州 341000）

据《中国心血管病报告2018》［1］，我国心血管疾病死亡率占第一位，占比超过全民所有疾病死亡的40%，并且随着人口老龄化及城镇化进程的加速，我国心血管疾病的患病率及死亡率呈现出明显上升趋势。氧化应激是指在病理状态下，由于内源性抗氧化防御系统不能及时对体内过多的活性氧进行清除，从而导致自由基（如羟基自由基、超氧阴离子）不断大量积累，诱导细胞内一些生物大分子物质（DNA、脂质、蛋白质等）产生氧化作用［2］。内皮细胞在血管功能调节扮演重要角色，内皮细胞的氧化应激损伤是心血管疾病一个重要诱导因素［3］。DNA甲基化和羟甲基化是研究最为广泛的表观遗传修饰［4］。DNA甲基化和羟甲基化与血管疾病的发生发展密不可分［5］。但是在心血管疾病研究过程中，氧化应激对内皮细胞甲基化和羟甲基化变化鲜有报道。

人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）是内皮细胞的一种，因为其具有干细胞的潜能，理论上可以传代50～60 次，是研究内皮细胞的模型系统，在进行血管内皮细胞实验的时候，经常用HUVECs，而不是选择血管（如主动脉、冠状动脉、脑动脉、肺动脉等）内皮细胞，是因为该类细胞需原代分离培养，在体外只能传非常有限的代数［6-7］。此外HUVECs 还常用于研究相关的低氧、炎症、氧化应激、感染反应等［8-9］。因此，本研究中我们通过采用过氧化氢（H2O2）处理HUVECs构建细胞氧化应激损伤模型，采用多重反应监测质谱定量（Multiple response monitoring mass spectrometry quantification，MRM-MS）方法检测甲基化和羟甲基化，研究氧化应激对HUVECs 甲基化和羟甲基化的变化，为阐明氧化应激通过引起血管内皮细胞中甲基化和羟甲基化变化从而诱导心血管疾病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器HUVECs 购于中国科学院（上海）细胞库；DMEM 细胞培养基、胎牛血清（FBS）、青-链霉素双抗和胰蛋白酶均购于美国Gibco 公司。H2O2溶液购于美国Sigma 公司。311 型二氧化碳培养箱和1300 series A2 超净工作台均购于美国Thermo Fisher Scientific 公司；倒置显微镜购于日本Olympus 公司；BWS-10 恒温水浴锅购于上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 细胞培养与处理HUVECs 培养于6 孔板中，采用DMEM 细胞培养液培养，添加有10% FBS 和1% 青-链霉素，随后置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养至细胞贴壁融合，用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化，随后对细胞按1∶3 比例进行传代培养，每2 天更换1 次培养液。取指数生长期细胞进行实验，将细胞加入DMEM 稀释后终浓度为1 mmol·L-1H2O2处理细胞建立氧化应激模型，以等体积的DMEM 培养基作为对照，培养0 h、1 h、4 h 和8 h 后收集细胞进行MRM-MS检测甲基化和羟甲基化率。

1.3 MRM-MS 检测甲基化和羟甲基化本实验由深圳华大基因完成。主要实验内容如下：

1.3.1 DNA 的提取和酶解采用Pure Link™Pro 96 Genomic DNA Purification Kit（美 国Invitrogen 公司）对各组细胞全基因组DNA 进行提取。操作步骤严格按试剂盒说明进行，各组取1 μg DNA 样品，经DNase Ⅰ、Alkaline Phosphatase、Exonuclease Ⅰ酶解成小分子片段，酶解完全后用1%琼脂糖凝胶电泳检验效果。

1.3.2 MRM-MS 检测液相色谱条件：Thermo-C18 色谱柱（4.6×250 mm，5 μm；美国Thermo Fisher Scientific 公司）；流速500 μL·min-1；进样量5 μL。流动相A：0.1% FA in H2O，流动相B：0.1% FA in Methanol。梯度洗脱程序：0～4 min，50% B；4～6 min，50%B；6～6.1 min，50%B降至5%B；6.1～15 min，维持5%B。

串联质谱条件：Turbo V离子源；正离子扫描；多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压5 500 V；离子源温度（TEM）400 ℃；碰撞气（CAD，N2）Medium；气帘气（CUR，N2）30 L·min-1；雾化气（GS1）45 L·h-1；辅助加热气（GS2）40 L·h-1。

1.4 统计分析所有实验数据均采用SPSS 22.0软件进行分析，数据以表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 H2O2处理后对HUVECs 中DNA 甲基化率的影响与对照组相比，HUVECs经H2O2处理后1 h、4 h 和8 h 组细胞中DNA 甲基化率均显着增加（P＜0.05），并且随着H2O2处理时间增加，细胞中DNA 甲基化率增加越显着，呈时间依赖性。见图1。

图1 H2O2处理后HUVECs中DNA甲基化率的变化

2.2 H2O2处理后对HUVECs 中DNA 羟甲基化率的影响与对照组相比，HUVECs经H2O2处理后1 h、4 h和8 h组细胞中DNA羟甲基化率均显着降低（P＜0.05）；其中H2O2处理1 h 和4 h 后两组之间细胞中DNA 羟甲基化率变化不显着，无统计学意义；但是经H2O2处理8 h 后，细胞中DNA 羟甲基化率显着降低（P＜0.05）。见图2。

图2 H2O2处理后HUVECs中DNA羟基化率的变化

2.3 H2O2处理后对HUVECs 中DNA 甲基化率和羟甲基化率总和的影响与对照组相比，HUVECs经H2O2处理后1 h、4 h和8 h组细胞中甲基化率和羟甲基化率总和均显着增加（P＜0.05），并且随着H2O2处理时间增加，细胞中DNA 甲基化率和羟甲基化率总和增加越显着，呈时间依赖性。见图3。

图3 H2O2处理后HUVECs中DNA甲基化率和羟基化率总和的变化

3 讨 论

大量的活性氧积累或者氧化应激刺激会增加血管通透性，诱导的血管内皮细胞功能紊乱，从而导致多种心血管疾病［10-11］。H2O2作为一种重要的活性氧分子可以引起HUVECs 细胞损伤，是经典内皮细胞氧化应激损伤模型［12］。但是氧化应激如何影响心血管疾病发展仍然大量未知。因此，研究氧化应激通过引起血管内皮细胞中甲基化和羟甲基化变化从而诱导心血管疾病，可能为心血管疾病针对性的防治提供了新的思路。

DNA 甲基化和羟甲基化是调控基因表达的常见表观遗传修饰，DNA 甲基化是指胞嘧啶在甲基转移酶的催化作用下以S-腺苷甲硫氨酸为供体，将甲基（-CH3）转移至胞嘧啶的第5 位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcyti-dine，5 mC）［13］。DNA 羟甲基化是指甲基胞嘧啶双加氧酶将羟基转移到5 mC上生成（5 hydroxyl methylcyti-dine，5 hmC）［14］。已有研究表明表观遗传学中DNA 甲基化修饰和羟甲基化修饰与冠心病等心血管疾病的发生发展密切相关［15］。高度甲基化的DNA 与组蛋白结合紧密，能够促进转录抑制因子、抑制转录激活因子与启动子区域的结合，从而抑制基因表达。在心血管疾病中，有研究报道，内皮细胞DNA 的异常甲基化与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，DNA 甲基化在动脉粥样硬化的早期病变起到一定的促进作用，它与影响动脉粥样硬化的危险因素具有一定相关性［16-17］。此外，有研究报道主动脉内皮细胞短时间暴露于高糖状态下时，可诱导NF-κBp65 亚单位启动子DNA 甲基化［18］。去甲基化可引起基因的重新活化和表达，5 mC 氧化为5 hmC 可能是几种活性DNA 去甲基化途径中的一步，在心血管疾病的发生和发展起重要作用［19］。如PENG 等［20］发现甲基胞嘧啶双加氧酶介导5 mC 转化5 hmC，甲基胞嘧啶双加氧酶基因缺失与晚期动脉粥样硬化病变有关。胡春晓等［21］研究发现老年心肌梗死患者外周血全基因组DNA 甲基化和羟甲基化水平显着增加，DNA 甲基化和羟甲基化水平与冠状动脉粥样硬化程度显着相关。上述研究表明，5 hmC 通过改变DNA 甲基化状态来阻止抑制基因和凋亡基因失活，5 hmC 水平的降低使得基因缺乏保护，这对心脑血管疾病有着提示作用。因此，本研究从DNA 甲基化修饰和羟甲基化方面着手，研究氧化应激是否通过改变内皮细胞中DNA 甲基化修饰和羟甲基化从而造成氧化损伤，从而进一步对心血管疾病发生和发展产生影响。本研究以H2O2处理HUVECs 建立氧化应激模型，结果发现与对照组细胞相比，经H2O2处理后的HUVECs 中DNA甲基化率均显着增加，并且随着H2O2处理时间增加，细胞中DNA 甲基化率增加越显着，呈时间依赖性。提示氧化应激会促进内皮细胞内DNA 甲基化率增加，心血管疾病早期病变可能与血管内皮细胞内DNA 甲基化率增加有关。此外，本研究还发现与对照组细胞相比，经H2O2处理后的HUVECs 中DNA羟甲基化率均显着降低，其中H2O2处理1 h 和4 h 后两组之间细胞中DNA 羟甲基化率变化不明显，但是H2O2处理8 h 后，细胞中DNA 羟甲基化率显着降低。提示氧化应激会降低内皮细胞内DNA 羟甲基化率，心血管疾病早期病变还可能与血管内皮细胞内DNA 羟甲基化率降低有关。本研究还发现与对照组细胞相比，经H2O2处理后的HUVECs 中DNA 甲基化率和羟甲基化率总和均显着增加，呈时间依赖性。表明HUVECs 经H2O2处理后细胞受到氧化应激可以增加细胞DNA 甲基化率，降低DNA 羟甲基化率，从而促进DNA 与组蛋白结合紧密，抑制基因表达。

综上所述，H2O2诱导HUVECs 氧化应激可能与其能促进内皮细胞中DNA 甲基化率，降低DNA 羟甲基化率有关。这一研究结果可为今后内皮细胞中DNA 甲基化和羟甲基化在心血管疾病中的深入研究以及针对性防治提供实验基础。