梅毒血清固定患者外周血细胞免疫功能的表达研究

林丽萍，朱亚丽，马启超，彭云杏，王红霞，徐超

梅毒血清固定患者外周血细胞免疫功能的表达研究

林丽萍，朱亚丽，马启超，彭云杏，王红霞，徐超

目的 分析梅毒血清固定患者外周血CD4、CD8、Th17、Treg细胞的表达情况，以探讨细胞免疫功能与梅毒血清固定的关系。方法 采用流式细胞仪检测梅毒血清固定患者、健康对照者及梅毒血清转阴患者外周血CD4、CD8、Treg、Th17细胞的水平，并进行统计分析。结果 血清固定组CD4和Th17与健康组比较明显减少；血清固定组CD8和Treg与健康组比较明显增多；血清固定组CD4和Th17与梅毒血清转阴组比较明显减少；血清固定组CD8和Treg与梅毒血清转阴组比较明显增多；差异均有统计学意义（均＜0.05）；梅毒血清转阴组与健康对照组CD4、CD8、Th17、Treg细胞差异均无统计学意义（均＞0.05）。结论 梅毒血清固定患者可能存在CD4、CD8、Th17、Treg等T细胞亚群的失衡，从而影响梅毒患者的细胞免疫功能，造成梅毒患者血清固定。

血清固定；Treg；Th17；CD4；CD8

梅毒血清固定一直是临床亟待解决的难题，可能与早期梅毒治疗、病期、类型、是否为复发或再感染、体内潜在病灶、机体细胞免疫受到抑制及合并其他疾病等多种因素有关。梅毒患者一旦发生血清固定，加大药物剂量、延长疗程也不能使血清学转阴。由于血清固定患者复发率高达35%[1]，患者心理压力巨大。目前血清固定形成的机制尚不清楚，传统研究认为梅毒血清固定患者存在细胞免疫失衡即CD4、CD8细胞等T细胞亚群的失衡[2]。本研究观察梅毒血清固定患者外周血CD4、CD8、Th17、Treg细胞的表达情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集 2012年10月至2014年9月宁波市鄞州区第二医院皮肤科梅毒血清固定患者和梅毒血清转阴患者各35例的血清标本。梅毒血清固定患者的判定标准为：确诊梅毒并经规则治疗，连续跟踪2年，不加热血清反应试验（TRUST）不转阴者，并排除再感染、神经梅毒及HIV感染者。血清固定组男21例，女14例；年龄20～51岁，平均（26.61±1.57）岁；血清TRUST稀释原倍（+）。血清转阴组男20例，女15例；年龄19～50岁，平均（25.87±1.43）岁。同时收集健康体检者30例为正常对照组，男16例，女14例；年龄19～50岁，平均（26.11±1.76）岁。3组患者一般资料差异无统计学意义（＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 试剂 CD3、CD4、CD8、CD25、抗IL-17的荧光抗体、同型对照抗体均购自Becton Dickinso公司；固定及破膜剂、淋巴细胞分离液、细胞培养液、PMA、Ivnomycin、BFA均购自美国Sigma公司；流式细胞仪EPICS.XL型（BackmanCoulter公司）。

1.2.2 标本制备 取患者外用血5 ml肝素抗凝，采用密度梯度法分离PBMC，并按6×106/ml浓度用RPMI1640重悬备用，IL-17分子在细胞内浓度较低，检测前需要先对细胞进行体外刺激培养，因而取出500l细胞悬液分别加入 25 g/L的PMA、1mg/L的伊屋诺霉素（ionomycin）和10 mg/L的BFA后，37℃、5%CO2培养箱培养4 h备用。

1.2.3 CD4和CD8细胞检测 取EDTA抗凝血100l加20l CD3、CD4、CD8三色荧光抗体，混匀放置20～30 min（室温避光），再加2 ml红细胞裂解液，裂解10～15min（室温避光），用PBS冲洗，最后500 l1%多聚甲醛PBS液固定细胞后上机检测。

1.2.4 Treg细胞检测 取4个试管各加入100 l未经培养的PBMC细胞悬液，其中3管分别加入相应的同型对照抗体作为阴性对照，检测管先加入CD4-FITC 和CD25PE-CY5抗体避光孵育，然后按说明书加入固定/破膜剂破膜后，再加入Foxp3-PE抗体进行细胞内分子标记，标本清洗后，PBS重悬上机检测。

1.2.5 Th17细胞检测 取经过体外刺激的PBMC细胞悬液，参照检测步骤，进行细胞表面标记，然后将细胞固定与破膜后加入PE标记的抗IL-17单克隆抗体进行细胞内分子标记，最后清洗，用PBS重悬上机检测。

1.3 统计方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法或Dunnett’s法。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

血清固定组CD4和Th17与健康组比较明显减少，差异均有统计学意义（均＜0.05）；血清固定组CD8和Treg与健康组比较明显增多，差异均有统计学意义（均＜0.05）；血清固定组CD4和Th17与梅毒血清转阴组比较明显减少，差异均有统计学意义（均＜0.05）；血清固定组CD8和Treg与梅毒血清转阴组比较明显增多，差异均有统计学意义（均＜0.05）；梅毒血清转阴组与健康对照组CD4、CD8、Th17、Treg细胞差异均无统计学意义（均＞0.05）。见表1。

表1 3组外周血CD4、CD8、Th17、Treg细胞的表达 %

3 讨论

梅毒是苍白螺旋体（TP）感染所引起的一种慢性经典的性传播疾病。近年来随着梅毒发病率的升高，血清固定的发生率也明显上升。目前血清固定发生的机制尚不完全清楚，国内外有研究发现血清固定患者存在免疫学方面的异常[3-4]。有学者认为细胞免疫在梅毒的病程中起着很重要的作用[5]。医学界普遍认为细胞免疫是清除体内TP的主要方式，其中又以T细胞介导的细胞免疫为主。众所周知，在胸腺的作用下，T淋巴细胞分化为成熟的CD4和CD8亚群。CD4细胞亚群主要是辅助性 T细胞，可分化为Th1、Th2细胞；CD8细胞亚群主要为免疫抑制性T细胞（Ts）。在机体抗梅毒螺旋体感染的过程中 CD4细胞发挥着重要作用，CD4细胞能分泌多种细胞因子，发挥具有特定的免疫调节和杀伤作用；CD8细胞在抗螺旋体感染的过程中通过抑制自身反应性 CD4细胞活性及梅毒螺旋体制动抗产生而抑制机体免疫反应，Ts增高表明细胞免疫功能受到抑制。有研究表明，血清固定患者存在细胞免疫失调与免疫抑制[6-7]，主要表现CD4淋巴细胞明显降低，CD8淋巴细胞明显升高，使得TP清除下降，造成TP残存而引发血清固定。本研究结果显示：血清固定组与健康对照组、血清转阴组相比较，外周血CD8细胞明显增高，CD4细胞明显降低，差异均有统计学意义（均＜0.05），与徐刚等[8]研究一致。由此进一步证实，血清固定患者机体内存在免疫不平衡和免疫抑制现象。

Treg、Thl7细胞是新近发现的两种新淋巴细胞亚群，成为近几年来免疫学研究的新热点。Treg细胞具有免疫抑制的特性，并同时表达CD25和转录因子Foxp3，诱导和维持机体的免疫耐受，主要分泌IL-4、IL-10和TGF-等细胞因子[9-10]。Thl7细胞能够分泌产生IL-17、IL-6、IL-22及TNF-等，与诱导炎性反应和自身免疫疾病有关[11]。有学者提出，人体内存在着Treg/Thl7细胞的平衡，某些疾病的发生可能正是由于初始CD4细胞在分化过程中出现了Treg/Thl7细胞的平衡偏移所造成的[12]。赵建斌等[12]研究显示，梅毒血清固定患者外周血淋巴细胞中存在Treg细胞比例及其转录因子Foxp3的表达升高，Th17细胞比例及其转录因子ROR-t的表达降低，即Treg/Thl7细胞的平衡偏移，推测梅毒血清固定的发病与此有关。本研究结果显示：外周血Treg细胞明显增高，Th17细胞明显降低，差异均有统计学意义（均＜0.05）。进一步证实Treg/ Thl7细胞失衡对血清梅毒固定的影响。

综上所述，CD4/CD8/Treg/Th17细胞间的平衡状态与梅毒血清固定可能存在着某种关联，了解其中的调控机制，就可以在今后的临床治疗过程中更多关注患者的免疫学状态，制定个性化免疫学干预方案，为解决梅毒血清固定问题带来新的途径。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.056

R759.1

A

1671-0800(2016)01-0105-03

2015-08-01（本文编辑：陈志翔）

315100宁波，宁波市鄞州区第二医院

徐超，Email：xuchaoharbin@163.com