白丽梅，董昔山

肺炎支原体（MP）是常见的呼吸道感染病原体，约30%感染者发生肺炎[1]。支原体肺炎无特异性症状，临床医生很难与其他病原菌感染所致肺炎区分开来[2]。MP检测技术众多，包括培养法、血清学抗原抗体检测等，培养法检测时间长，对于实验室要求较高，且容易受到送检样本中其他病原菌的干扰；血清MP-IgM一般于感染后1周出现，并且血清学抗原抗体检测受患者自身免疫水平影响[3]。因此，临床迫切需求一种快速、准确的MP检测新方法。RNA恒温扩增法是（SAT）近年来出现的一种新型的病原体分子诊断技术，是以活菌的特异性RNA基因片段作为扩增对象，具有无创、简单等优点[4]。本研究对咳嗽、发热症状患者的临床样本采用SAT法进行MPRNA检测，探讨SAT-MP（RNA）结合胸部X线检查在早期支原体肺炎中的诊断价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取浙江新安国际医院2016年10月至2017年4月收治的咳嗽、发热症状患者463例，其中男241例，女222例；年龄2个月至14岁，中位年龄4.5岁；病程 2 ～ 12 d，平均（4.72±1.82）d。

1.2 仪器及试剂 上海宏石SLAN-96S型实时荧光定量PCR仪，MP核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）购自上海仁度生物科技有限公司；MP-IgM检测试剂盒（化学发光法）由深圳亚辉龙公司生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 SAT-MP检测 使用一次性无菌咽拭子采集入院1 d患者咽部分泌物，将拭子头放入含1 ml 0.9%氯化钠注射液的PE管中晃动10 s，贴管壁挤干后丢弃拭子头。取500 l样本加入500 l裂解液进行裂解，取裂解后的样本400 l加入100 l核酸提取液。60℃恒温5min，室温放置10min，于磁性分离架放置5min，吸净管中的液体，洗涤2次。加入40 l扩增液，震荡5 s，取30 l悬液至新的PCR 管中，60 ℃，10 min；42 ℃，5 min；加入10 l扩增酶，在上海宏石SLAN-96S扩增仪上进行扩增，反应程序为42℃，1min，共40个循环，FAM通道收集荧光信号。读取每个样本的RNA扩增循环数（dt值）。阳性和阴性对照同法进行操作。判断标准：dt值≤35为阳性；dt值≥40为阴性；dt值35～40的样本重新检测，dt值≤35为阳性，＞35为阴性。

1.3.2 MP-IgM抗体检测 分别取患儿入院2d和7～10 d时空腹静脉血2 ml，2 000 r/ming离心10 min，取血清按照MP-IgM检测试剂盒说明书检测。阳性标准：MP-IgM抗体≥1.10 Col。

1.3.3 X线检查 对SAT-MP检查阳性的患者行胸部正位X线检查。

1.4 统计方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析，计数资料比较采用2检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAT-MP检查结果 入院24 h时血清MP-IgM阳性14例（3.02%），经双份血清MP抗体检查确诊MP感染19例（4.10%），经SAT-MP检查共发现36例（7.77%）MP感染患者。SAT-MP诊断MP感染的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为36.11%（13/36）、98.59%（421/427）、68.42%（13/19）、94.82%（421/444）。见表 1。

2.2 X线检查结果 36例SAT-MP检测阳性患者胸部正位X线检查，均可见肺炎病变。其中大叶实质浸润8例，表现为扇形或者三角形大片状阴影，边界清晰，左肺3例，右肺3例，双肺2例；小叶性实质浸润14例，表现为自肺门向外呈扇形或者放射状延伸，可见大小不一的阴影，部分病灶融合呈磨玻璃密度，左肺2例，右肺4例，双肺8例；间质浸润性14例，表现为肺纹理变粗、增加，可见网状和点状阴影，左肺4例，右肺8例，双肺2例。

3 讨论

MP感染是临床常见的呼吸道感染病原体，支原体肺炎好发于学龄期儿童，以5岁以下居多[4]。MP感染早期肺部体征不明显，影像学改变比较明显但具有多样性，使得医生难以做出诊断结论。经典培养法培养条件苛刻，检测周期长不适用于早期诊断。快速培养法易受杂菌影响，特异性不高。血清学中的双份血清特异性抗体滴度检测特异性高，但需在患者治疗期间采集2次血液进行检测，抗体的产生需1周左右的时间并且受机体免疫功能的影响较大，降低了临床诊断效率。MP DNA检测的灵敏度和特异度均较高[5]。但临床DNA检测无法区分MP的携带状态，部分患者感染1个月时其 DNA的检出率仍然高达50%，MP DNA持续携带中位数时间为7周，个别甚至长达7个月之久[6]；另一方面，DNA检测技术无法区分“活菌”和“死菌”，导致检测结果和临床相关性不足。

SAT技术是采用 M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶对靶RNA进行恒温扩增检测，具有如下优势[7]：（1）区分“活菌”和“死菌”，靶RNA由活菌产生，一旦病原体死亡，RNA快速降解，因此检测结果与临床具有良好的相关性，指导临床合理用药，减少无效治疗；（2）诊断活动性感染，当病原体处于活动性感染状态时，RNA转录较为活跃，dt值较低，当病原体处于潜伏状态时，靶RNA不转录；（3）防止实验室污染，由于SAT检测对象为 RNA，扩增中产生的产物也是RNA，而RNA极易降解，避免了DNA扩增过程中可能造成的实验室污染问题。本研究显示，SAT-MP检测疑似支原体肺炎患者咽拭子中 MP感染的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为36.11%、98.59%、68.42%、94.82%，提示该法检测 MP的特异度较高。MP抗体检测入院24h内MP感染阳性率为3.02%（14/463），低于最终确诊MP感染19例（4.10%），提示SAT-MP对MP的诊断早于 MP抗体检测。本研究36例SAT-MP阳性患者进行胸部正位X线检查显示，均可见肺部病变，提示SAT-MP与X线检查结果具有极高的一致性，反映SAT-MP与临床具有非常高的相关性。

表1 463例患者MP感染情况分析 例

参考文献：

[1]张马军,闫涛.肺炎支原体的实验室检测结果及药敏情况[J].健康研究,2016,36(6):675-676.

[2]黄梅.小儿肺炎支原体肺炎临床表现及发病机制分析[J].中国妇幼保健,2014,29(2):223-225.

[3]张志英,韩淑娟,张小宁,等.肺炎痰液支原体DNA联合血清MP-IgM抗体检测在小儿肺炎支原体肺炎早期诊断中的价值[J].中国临床新医学,2017,10(9):866-868.

[4]刘春灵.肺炎支原体肺炎的诊断[J].中国医刊,2009,44(11):16-18.

[5]Diaz MH,Benitez AJ,Winchell JM.Investigations of Mycoplasma pneumoniae infections in the United States:trends in molecular typing and macrolide resistance from 2006 to 2013[J].Journal of Clinical Microbiology,2015,53(1):124-130.

[6]Li W,Fang Y,Shen H,et al.Evaluation of a real-time method of simultaneous amplification and testing in diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in children with pneumonia[J].Plos One,2017,12(5):e0177842.

[7]Yamada Y,Doi M,Kamituna M,et al.Two cases of Mycoplasma pneumoniae bronchopneumonia diagnosed with LAMP(loop-mediated isothermal amplification)as arapidassay[J].Kansenshogaku Zasshi the Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases,2014,88(2):160.