陈筱山 综述，晏 勇 审校

(重庆医科大学附属第一医院神经内科 400016)

微RNA(micro RNA，miRNA)是长度为20～24个核苷酸(nt)的内源性非编码蛋白RNA基因。在动植物细胞中，通过与靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′端非编码序列(3′-uncoding region,3′-UTR)相互作用,在翻译后水平抑制靶基因活性或降解靶基因来调节其表达的活性。miRNA表达具有高度保守性、时序性和组织特异性。miRNA在中枢神经系统广泛分布，对神经发育、分化、成熟发挥重要调节作用[1]。miRNA功能异常与神经变性疾病有密切的关系。阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是常见的神经变性疾病，以记忆功能损害及认知功能障碍为主要变现，神经元丧失、老年斑(SP)形成和神经纤维缠结(NFT)为主要特征。研究表明，miRNA功能异常与AD关系密切，可能作为诊断AD的生物标志物及可能的治疗靶点，本文就相关研究进展进行综述。

1 miRNA的合成及生物学特点

1.1miRNA的合成 已经发现人类的miRNA超过900个,且这一数字还在不断更新。在胞核内，大部分miRNA被RNA聚合酶II(RNA polymerase II，RnaseII)转录形成几千个nt，内含发卡样结构的初级转录体(primary transcripts，pri-miRNA)，之后在RNA聚合酶III(RNA polymeraseIII，RnaseIII)Drosha作用下产生约70 nt长的，包含发卡样miRNA前体(pre-miRNA)，在pre-miRNA的3′端有2 nt的悬垂(overhang)结构。悬垂结构被Exportin-5蛋白识别，转运pre-miRNA至胞质。在胞质中，pre-miRNA被RnaseIII酶Dicer裂解，形成一个约含21 nt的成熟miRNA和它的卫星序列miRNA*的miRNA：miRNA*二倍体，在解旋酶作用下，成熟的miRNA被包含形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)，同时miRNA*被降解。在RISC和Argonaute(Ago)蛋白作用下miRNA与靶mRNA(target mRNA)结合。miRNA 5′端的2～8个残基被称为种子序列(seed sequence)，含有与mRNA的3′-UTR的互补序列。根据miRNA与其目标mRNA序列互补性不同，目标mRNA可以被裂解、降解或翻译抑制。完全的序列互补造成mRNA降解，不完全的序列互补导致翻译抑制[2]。一种miRNA可以作用于上百个靶基因，据此估算，在动物中miRNA可以调节三分之一的蛋白质编码基因[3]。根据miRNA种子序列相似性的不同将miRNA分为不同的家族。不同物种间三分之一的miRNA是高度保守的，在鼠和人成熟miRNA间有大约60%的保守序列被发现[4]。通过影响多种目标转录体和蛋白的表达，miRNA在发育、分化、扩增、凋亡和代谢等多种细胞过程中发挥着重要作用。

1.2miRNA的神经生物学特性 miRNA在中枢神经系统内分布丰富并呈特异性表达，在脑、神经元发育、分化、神经元可塑性和神经元特异基因表达调节具有重要作用[4-5]。基因切除Dicer酶导致成熟miRNA缺失，在斑马鱼(zebrafish)Dicer敲除模型中观察到严重的脑形态异常。敲除小鼠的Dicer基因可以导致神经变性和中脑的多巴胺神经元、小脑的Purkinje细胞以及新皮层神经元等神经元亚细胞死亡。在皮层和海马中Dicer酶的缺失影响细胞和组织形态、轴突导向和凋亡[2]。更多研究发现miRNA干扰中枢神经系统关键调节过程，参与神经干细胞分化、神经突增生和突触形成。

在秀丽线虫(C.elegans)，miRNA是保持味觉神经元特异性所必需的；在果蝇(Drosophila)中，miRNA维持色觉受体正确分化；在脊椎动物中，miRNA则在突触水平参与突触可塑性和学习等更复杂的机制[5-6]。

人脑通过突触组成复杂的神经元网络，突触数量和结构的调节是记忆产生的基本机制。新蛋白合成需要某些形式长时程记忆的建立，在一些情况下新合成的蛋白来自于神经过程内局部mRNA的翻译。一部分mRNA位于树突杆和棘突上，这些部位有从树突和兴奋性突触来源、富含小肌动蛋白的突起。研究发现miRNA对树突局部mRNA的翻译控制功能，miRNA参与轴突局部蛋白合成的调节。如分布在海马神经元轴突树突复合体中的脑特异性miR-134通过抑制Lim区域包含蛋白激酶-1(Lim-domain-containing protein kinase 1，Limk-1)的翻译调节突触的可塑性[7]。下调Limk-1蛋白合成限制树突棘的生长，限制兴奋性突触发育。而当神经元暴露给脑源性神经营养因子后，Limk-1和miR-134的相互作用减低。miR-138是另一种分布于树突的脑特异性miRNA，通过抑制在轴突和相关膜控制蛋白棕榈化状态的酶酰基蛋白硫酯酶-1(APT-1)的表达，负性调节树突棘的形态。

研究表明神经特异性miRNA在鼠中枢神经胚胎发育和分化中的作用。其中，miRNA-9和miRNA-124与神经形成特别相关。体外实验中，它们过度表达造成星型胶质细胞分化差，而抑制miRNA-9或者抑制二者导致神经元数目减少。在小鼠中，miRNA-9在胚胎期大脑皮层中丰富表达，在海马水平参与了Cajal-Retzius细胞的正确分化，这种分化至少部分通过SATA3磷酸化至TYR705介导[8]。miRNA-124是中枢神经系统内丰富表达的miRNA之一。在人和鼠中，miRNA编码的、位于3个不同染色体上的3个基因被确认。在鼠中，3种基因相伴重叠翻译。miRNA-124从最初神经元前体持续到最终分化细胞都可以检测到，与RE-1沉默转录因子(RE-1 silencing transcription factor)相互作用，而RE-1沉默转录因子具有在神经元中抑制神经特异性基因的作用。在翻译后水平，miR-124具有选择性剪切抑制剂的作用，抑制RNA结合蛋白PTBR1，从而产生神经特异性转录体。除了促进神经元特异性基因表达，Yu等[9]研究发现在鼠胚胎肿瘤中miR-124参与了神经突形成和神经元分化。其他如miRNA-125、miRNA-128、miRNA-133、miRNA-388等也与神经突增生和神经分化有关[10]。

2 miRNA与AD的关系

2.1AD的病因 尽管多种分子病变在AD中被发现，但AD的病因尚未完全明确，其中，约占AD发病1%的家族型AD与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor peptide，APP)基因、早老素基因(presenilin，PS)突变有关，而超过90%的散发性AD病因不明。散发性AD与家族性AD病理变化与造成的认知功能障碍相似。APP和淀粉样蛋白(Aβ)代谢异常的“Aβ瀑布学说”是AD发病的关键，主要影响海马和皮层区域，造成早期的轴突及神经元功能障碍、形成由异常聚集的Aβ和主要由tau蛋白组成的神经元纤维缠结(NFT)构成的Aβ斑块。AD的发病还与炎症、凋亡、细胞周期异常、线粒体功能障碍、血管因素等多种因素有关。miRNA可以调节Aβ病因相关的各个环节，如Aβ代谢和炎症、凋亡等基因都可能做为miRNA作用的靶点，参与并调节AD的病理进程。

Aβ沉积是老年斑的主要成分，是AD发病的最主要病理变化之一，Aβ是由APP经过淀粉样物质途径和非淀粉样物质途径代谢产生。在淀粉样物质途径中，APP在β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme 1，BACE-1)作用下形成C99，C99做为底物在γ分泌酶作用下形成不溶、有毒性的Aβ，其中Aβ 42最易于形成纤维聚集。其中BACE-1是调节Aβ生成的限速酶。因此，miRNA对与Aβ代谢的APP及BACE-1的mRNA的调节成为研究热点。

2.2miRNA与APP 由于APP在AD发病中的重要作用，在许多研究中被作为miRNA的靶mRNA。Ryusuke等[11]发现在秀丽线虫中，做为APP类似物的apl-1功能在不同发育阶段受到let-7家族mirRNA的基因调节。Patel等[12]和Hébert等[13]体外实验证实miR-106a、miR-520c以及miR-106家族的miR-17-p、miR-20a和miR-106b与人类APP相关。在转染的人类HEK-293细胞中，miR-106a和miR-520c负性调节包含APP的3′-UTR区域预测靶miRNA序列的基因表达。与未转染靶miRNA序列的细胞相比，在人细胞株中高表达的miR-106a和miR-520c降低内源性50%的APP水平[12]。在发育鼠脑和原代神经元中，后转录水平高表达的miR-20a、miR-17-p和miR-106b与增高的APP水平相关[13]。Vilardo等[14]在大鼠原代海马神经元中证实APP水平通过miRNA/RISC途径被调节，沉默Ago2表达增加APP蛋白水平，运用定点突变的方法，证实miR-101的反应元件(responsive elements，RE)在APP 3′-UTR区，抑制内源性miR-101表达增加APP水平，而慢病毒方法介导的过度表达的miR-101则显着降低海马神经元APP和Aβ水平。而Justin等[15]也证实给人类Hela细胞miR-101明显降低APP水平，而给miR-101的反义抑制剂则出现相反的效果，在阻断miR-101和APP 3′-UTR的靶mRNA升高APP水平。

miRNA除了对APP基因的转录后调节外，还参与了对神经元mRNA的微调(fine-tuning)即选择性剪接。有研究表明体内实验中，后有丝分裂神经元缺乏miRNA与APP的外显子7和8的包含有关，miR-124的异常表达可以逆转这种现象[16]。在删除miR-124目标基因的内源性多聚嘧啶束结合蛋白1(PTBP1)后可以出现同样的效果。神经特异性的miR-124在AD脑中表达下调，说明特殊的miRNA参与了神经元的APP选择性剪接。

2.3miRNA与BACE-1 BACE-1作为Aβ代谢途径中的限速酶，在Aβ产生中起着关键作用，也成为AD治疗研究中关注的靶点。Wang等[17]研究发现miR-107在AD组中，甚至AD的发病早期即出现显着降低。在AD的进展过程中，BACE-1 mRNA水平随着miR-107水平减少而增加。生物信息学及荧光素酶分析方法证实miR-107与BACE-1的3′-UTR mRNA序列结合。Hébert等[18]检测了5例散发性AD患者的前颞叶皮层的miRNA表达，发现包括miR-9、miR-29b、miR-181在内的13种miRNA丰富表达，在鼠脑衰老过程中BACE-1的水平降低，与之相关的miR-29a、miR-29b1增高。体外实验中，对培养细胞的荧光素酶分析证实miR-29a、miR-29b1与BACE-1的3′-UTR相关。Bossonneault等[19]在鼠AD模型中发现BACE-1的蛋白水平与miR-298和miR-328呈负相关性，进一步运用鼠细胞株也证实了这些miRNA与BACE-1 mRNA 3′-UTR结合位点结合。

2.4miRNA与其他靶mRNA 除了BACE-1和APP之外，也有对神经元中其他的功能不明的转录体的研究。Lukiw等[20]研究了作为炎症反应抑制因子的补体因子H(complement factor H，CFH)，结果发现在AD患者脑中，神经元、胶质细胞共培养时，miR-146a水平上调而CFH水平下调，miR-146a与CFH的3′-UTR直接作用。而Wang等[21]研究发现在APP swe/PS双转基因AD模型鼠皮层中，miR-34a水平高表达，进一步的序列分析表明miR-34a与Bcl-2的3′-UTR呈反相关，在SH-SY5Y细胞中miR-34a的表达直接抑制Bcl-2的翻译，而敲除miR-34a后Bcl-2的水平升高，说明异常的miR-34a通过Bcl-2参与了AD的病理过程。Wang等[22]研究发现，利用同样的双转基因AD动物模型miR-106b和转化生长因子βII型受体(TGF-βII，TβRII)异常表达，进一步序列分析证实miR-106b与TβRII的3′-UTR结合并呈反相关性，说明异常的miR-106b通过TβRII参与了AD的病理过程。

Shioya等[23]使用实时定量PCR发现在AD患者脑中与神经元生长、引导轴突生长的神经元导航因子(neurone navigator 3，NAV3)的mRNA水平升高并伴miR-29a水平显着降低，进一步使用荧光素酶分析方法证实miR-29a下调NAV3的水平，而在AD患者额叶皮层的锥体神经元中NAV3表达增高，此项研究说明在AD患者脑中，下调的miR-29a水平可能通过增加NAV3表达影响神经变性进程。

3 miRNA在AD中的应用

3.1miRNA作为AD诊断的标志物 已有研究表明在AD患者死后的脑标本中miRNA的异常表达。而AD患者脑脊液中磷酸化tau蛋白，总tau蛋白升高以及下降的Aβ42可以作为AD诊断的早期生物学标志物[24]。脑中及其体液中相关表达异常的miRNA是否可以作为AD诊断的生物学标志物？Hyman等[25]研究发现与16例正常年老对照组比较，16例AD患者血单核细胞miR-34a和miR-181b的表达显着增高。Cogswell等[26]的研究表明在AD患者中miRNA不仅在中枢神经系统表达异常，而且在其脑脊液中也有异常表达。在Braak分级5～6级的AD患者小脑、海马和额中沟区发现miR-9、miR-132下调。在AD脑脊液中miR-146b水平下调而在脑中丰富的miR-138则在较高的水平表达。在人单核细胞中，miR-146a负性调节Toll样受体(Toll like receptor，TLR)和激酶信号途径，是判断肺鳞状细胞癌预后因子，但是它在神经细胞中的作用还不清楚。在大鼠海马神经元中，miR-138负性调节树突形状而对神经元非常重要[27]，但是，miR-138的改变是否仅发生在AD或其他神经变性疾病中需要进一步的研究。因为神经元或者其他神经细胞胞质中miRNA和细胞外的miRNA的变化及相关性等尚不明确，因此，还不能将miRNA作为确诊AD的生物标志物。

3.2miRNA与AD的治疗 miRNA在AD中的异常表达导致神经损失及病变，因此，调节表达与疾病相关的异常miRNA，可以改变疾病的进展，使miRNA可能成为治疗疾病的潜在靶点。运用特殊修饰的反义寡链核苷酸即反miRNA可以调节在疾病中过高表达的miRNA[28]。Krützfeldt等[29]报道化学合成的寡核苷酸Antagomirs可以在小鼠体内沉默特异miRNA。通过静脉注射Antagomirs后可以对抗多种miRNA，在肝脏、心脏、肺、肾、肌肉中相应的miR-16、miR-122、miR-192和miR-194均明显降低。在同样的研究组[30]，体内注射时鼠中枢神经系统的miRNA水平并没有沉默，而给皮层局部注射后则出现沉默miRNA的效果。除了直接抑制的方法，还有通过下调miRNA的生物合成的间接的方法。例如四环素诱导的shRNA被用来下调miRNA合成过程的关键酶Drosha和Dicer，但是下调这一途径可能对所有miRNA都有作用。另一方面，一些下调的miRNA促进疾病进展，如在一些肿瘤中miRNA水平下降，说明这种miRNA可能具有抑制肿瘤作用。这时可以增加成熟的miRNA至相应的组织细胞中，在这种状态下，使用小干扰RNA(siRNA)的合成RNA复合体，模拟miRNA二倍体从而被RISC复合体识别，这种复合体通过装载成熟miRNA的序列特征成为内源性miRNA[31]。由于稳定性及释放策略等困难这一方法在体内的效果仍需进一步研究。

4 展 望

由于一种miRNA可以作用于多个靶RNA，多种miRNA可以作用于同一个靶RNA，而不同miRNA之间存在相互作用，形成了复杂的miRNA网络。而Schonrock等[32]研究表明，在给鼠海马神经元Aβ42刺激后，神经元miRNA水平明显表达异常。因此，对于异常表达的miRNA是导致AD发病还是AD病变继发的miRNA异常，即如何造成异常miRNA，这一问题目前还不能回答。说明目前miRNA与AD的研究尚处于初步阶段，其详细的调节机制需要更多的深入研究。但是，随着高通量miRNA芯片、生物信息学等技术的发展及应用，越来越多与AD相关的具有调节作用的miRNA及其调节机制会被发现，相信会给AD的早期诊断与治疗提供更多新的方法和靶标。

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