李 佳，陆会平，冯振博，莫伟嘉

（广西医科大学第一附属医院病理科，南宁 530021）

在细胞培养过程中，经常需要冻存一部分细胞，避免培养细胞表型的改变而导致重复实验条件不一的状况，并为进一步的实验保存状态良好的细胞。细胞一般采用液氮低温保存，冻存及复苏时必须遵循“慢冻快融”的原则。本课题组在冻存慢病毒转染肝癌细胞株HepG2细胞时，尝试了多种不同配方的细胞冻存液，最后筛选出一种理想的可用于液氮保存慢病毒转染后HepG2细胞的冻存液。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 细胞株HepG2细胞及其慢病毒转染后稳转细胞株为本实验室保存。完全DMEM培养基由南京凯基生物科技发展有限公司提供，胎牛血清（FBS）由杭州四季青提供，胰酶由碧云天生物技术研究所提供，甘油和二甲基亚砜（DMSO）由北京索莱宝科技有限公司提供。－20℃冰箱由海尔电器公司提供，－80℃超低温冰箱由日本三洋公司提供，普通高速离心机由德国Eppendorf公司提供，酶标仪 Model－450由美国Bio－Rad公司提供，液氮罐为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 冻存方法 常规胰酶消化细胞，用完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞成单细胞悬液，1000r／min离心1min后弃去上清液，分组加入以下冻存液：分别采用甘油和DMSO为保护剂，按以下配方各配备4种比例冻存液。（1）A液，DMEM∶FBS∶保护剂＝7∶2∶1；（2）B液，DMEM∶FBS∶保护剂＝6∶3∶1；（3）C液，DMEM∶FBS∶保护剂＝5∶4∶1；（4）D液，DMEM∶FBS∶保护剂＝0∶9∶1。然后轻轻混匀，冻存前统一调整细胞密度到1×106个／毫升，将细胞悬液移至冻存管，每管1.5mL，梯度降温冻存，将冻存管置于4℃冰箱30min，－20℃60～120min后转移至－80℃过夜（16h），转至液氮保存。

1.2.2 细胞的复苏 从液氮中取出冻存管，迅速置于40℃水浴箱中快速摇动，使其迅速融化后，将细胞悬液加入已放置4 mL含10%FBS的完全DMEM培养基的培养瓶中，轻轻混匀后置于37℃，5%CO2培养箱培养。

1.2.3 倒置相差显微镜下观察 复苏细胞6～8h后换液，在倒置相差显微镜下观察复苏后细胞的存活情况，按已贴壁细胞即为存活细胞，未贴壁细胞为死亡细胞的原则，观察复苏后细胞的存活率。

1.2.4 MTT法 将各组细胞接种于96孔板，2×103个／孔，每组细胞均做5个复孔，分别于种板后24、48、72、96h加入20μL MTT溶液，继续培养4h后，小心吸尽培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min后上酶标仪检测490nm处吸光度值，绘制生长曲线。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料用表示，组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用t检验，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 倒置相差显微镜下观察的细胞存活率 采用甘油作为冻存保护剂时，转染的细胞存活，且冻存液比例为0∶9∶1（DMEM∶FBS∶甘油）时，细胞存活率明显高于其他3组，差异有统计学意义（F＝14.811，P＝0.001）；未转染细胞的存活率均达到60%及以上，不同比例的冻存液组间差异无统计学意义（F＝1.473，P＝0.293）。采用DMSO作为冻存保护剂时，转染组细胞存活率为0%，未转染细胞的存活率均达到60%及以上，不同比例的冻存液组间差异无统计学意义（F＝0.890，P＝0.487）。见表1。

表1 倒置相差显微镜下观察的细胞复苏后的存活率

2.2 MTT法检测冻存细胞复苏后的生长情况 两组细胞在不同比例冻存液冻存复苏后的生长情况见图1。图中结果显示转染后细胞以甘油作为冻存保护剂细胞存活（图1A），且冻存液中血清含量越高，复苏后细胞的增殖能力越强（P＜0.05）；而用DMSO作为冻存保护剂冻存的转染细胞复苏后成活率几近于0%（图1B）。无论是以DMSO还是以甘油作为冻存保护剂，HepG2细胞复苏后都能存活，且复苏后均具有较好的增殖能力（图1C，图1D）。

图1 各组细胞复苏后生长曲线图

3 讨 论

目前认为细胞处在对数生长期时最适合冻存，而细胞冻存需要遵循“慢冻”的原则［1］。除此之外，冻存液的成分及其比例对细胞冻存、复苏效果也起着很重要的作用，其中冻存保护剂和血清是在细胞冻存过程中最为重要的两个因素。

Wastts等［2］认为冻存细胞时一定要加入保护剂。如果直接冻存，细胞内形成的冰晶会导致胞内蛋白质、酶变性，溶酶体膜损伤，细胞核内DNA受损［3］，从而引起细胞死亡。因此，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键［4］。冻存保护剂除了可以减少降温过程中胞内外冰晶的形成，还可降低“溶质效应”。目前最常用的冻存保护剂有DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。其中，DMSO相对分子质量小、渗透性强，通过降低冻存液冰点和细胞内外的电解质浓度，改变细胞膜的通透性，保护细胞免受冷冻损伤［5－6］。Chesne等［7］报道，DMSO与甘油等冻存保护剂相比较，具有更好的保护作用。但DMSO具有一定的细胞毒性［8］，高浓度不利于细胞的冷冻保护。Diener等［9］认为10%DMSO 为最佳冻存剂浓度［9］。然而，于丽敏［10］报道，对耐药的肿瘤细胞株进行冻存时，使用10%～15%的甘油（占冻存液百分比）作为保护剂，细胞存活率明显高于用DMSO作为保护剂的，此结果与本实验结果相同。是否在肿瘤细胞受到外界损伤后（药物刺激、慢病毒感染等），细胞对DMSO敏感性提高，无法抵御其细胞毒性，进而影响复苏效果，这其中的机制仍有待研究。

FBS中含有丰富的细胞生长所必需的营养物质，是细胞培养中最天然的培养基［11］。若含DMSO的冻存液中血清浓度低则细胞复苏后活力低，原因可能是FBS可以中和DMSO的毒性，以及血清中的纤维粘连素有助于细胞贴壁［12－13］。本实验结果也表明血清浓度对复苏后细胞的活力有一定的影响，冻存液中血清含量越高，复苏后细胞的增殖能力越强。

总而言之，细胞冻存对实验的顺利进展至关重要。由本实验结果可知，冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液为90%FBS＋10%甘油。望本研究结果能给其他课题组的细胞冻存提供一种借鉴的方法。

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