徐其岭，闫 莉
（1．郑州人民医院神经外科，郑州450000；2．河南省人民医院CT室，郑州450000）
颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是对脑组织的一种物理性损伤，可引起暂时性或永久性脑功能损伤，继发性的脑损伤被认为是患者病情加重的重要因素［1］。尽管一系列的医疗干预措施如采用高压氧治疗、亚低温以及早期康复治疗在很大程度上能降低颅脑损伤的病死率，改善预后，提高生存质量。但目前仍然没有行之有效的治疗TBI的神经保护药物［2］。研究表明TBI后，坏死神经组织产生的炎性反应，如氧化应激产生的大量活性氧自由基对脑组织具有损害作用，并在继发性脑组织损伤和功能恢复中发挥重要作用。富氢生理盐水（HS）是一种优质的选择性抗氧化剂，其在临床医学实验中的研究主要集中于对缺血再灌注引起的肺脏、肠及脑损伤的保护作用。目前关于HS对重度颅脑损伤（severe trau matic brain injury，STBI）引起的机体氧化应激损伤的影响作用尚不明了，本研究通过建立STBI大鼠模型，给予HS治疗，检测大鼠血浆中丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性，探讨HS对TBI大鼠机体氧化应激水平的影响作用。
1 材料与方法
1．1 动物选择 健康的雄性Wistar大鼠60只，体质量250～300 g，由河南省动物实验中心提供。所有实验动物给予国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮食饮水，动物均在相同条件下进行饲养。
1．2 大鼠STBI模型的建立 根据参考文献资料，采用控制性皮质撞击损伤进行大鼠STBI模型的建立［3-4］。将大鼠用40 mg／kg戊巴比妥钠麻醉后固定于立体定向仪上。用硫化物脱毛剂除去大鼠头顶部被毛，顶部皮肤用碘伏消毒后切开，分离暴露颅骨。采用高速钻机行6 mm颅骨切除术。致伤点选择介于人字缝和前囱缝合线的右侧感觉运动皮质，用带有尖端直径5 mm的气动活塞撞击器装置以4．0 m／s的速度撞击脑部达到3．0 mm深度，并置于脑部120 min建立STBI模型。手术后，用骨蜡进行密封并缝合皮肤。假手术组仅进行颅骨开窗，不做打击致伤。
1．3 HS的制备 HS的制备参考文献［5-6］进行。将袋装250 mL医用生理盐水抽出50 mL，加入50 mL纯净的氢气（购自上海基量标准气体有限公司，纯度为100%）并充分混合。将含氢的生理盐水置于0．4 MPa压力下稳压12～24 h，达到饱和状态，制备HS，使氢气浓度保持在0．6 mmol／L左右，经r辐射消毒灭菌后装于铝袋中常压4℃保存。HS的浓度采用气相色谱法进行检测［7］。HS需要每周新鲜配制保证氢的浓度不低于0．6 mmol／L。
1．4 动物分组及实验方案 将60只大鼠随机分为假手术组、STBI＋生理盐水（NS）组和STBI＋HS组，每组20只。STBI＋NS组在STBI手术后5 min内经腹腔注射NS 10 mL／kg，STBI＋HS组在STBI术后5 min内经腹腔注射HS 10 mL／kg。3组动物分别于STBI术前和术后12、24、48 h检测血浆中MAD水平以及SOD和GSH-PX的活性。
1．5 指标检测
1．5．1 血浆样本中MDA水平的检测 依据硫代巴比妥酸比色法进行。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明操作。其中样品中MDA含量＝（测定管吸光度-测定空白管吸光度）／（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×10 mmol／L×样本稀释倍数。
1．5．2 血浆样本中SOD活性的检测 依据黄嘌呤氧化酶法进行。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明操作。样品中SOD活性＝（对照管吸光度-测定管吸光度）×稀释倍数／对照管吸光度×1／2。
1．5．3 血浆样本中GSH-PX活性的检测 依据5，5′-二硫代-双-硝基苯甲酸显色法。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明操作。GSH-PX活性＝（对照管吸光度-测定管吸光度）×标准管浓度×样本稀释倍数。
1．6 统计学处理 采用SPSS16．0统计软件进行数据分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P＜0．05说明差异有统计学意义。
2 结 果
2．1 血浆中MAD水平 与同组术前相比，STBI＋NS组及STBI＋HS组的MDA水平在术后24 h和48 h明显升高（P＜0．05）。与假手术组比较，STBI＋NS组及STBI＋HS组动物血浆中MDA水平在术后24 h和48 h均明显升高（P＜0．05）。与STBI＋NS组相比，STBI＋HS组的MDA水平在术后24 h和48 h明显降低（P＜0．05）。见表1。
2．2 血浆中SOD活性 与同组术前相比，STBI＋NS组及STBI＋HS组的SOD活性在术后12 h有所增高（P＜0．05），但在24 h和48 h明显降低（P＜0．05）。与假手术组比较，STBI＋NS组及STBI＋HS组动物血浆中SOD活性在术后24 h和48 h均明显降低（P＜0．05）。与STBI＋NS组相比，STBI＋HS组的SOD活性在术后24 h和48 h明显升高（P＜0．05）。见表2。
2．3 血浆中GSH-PX活性 与同组术前相比，STBI＋NS组及STBI＋HS组的GSH-PX活性在术后12 h有所增高（P＜0．05），但在24 h和48 h明显降低（P＜0．05）。与假手术组比较，STBI＋NS组及STBI＋HS组动物血浆中GSH-PX活性在术后24 h和48 h均明显降低（P＜0．05）。与STBI＋NS组相比，STBI＋HS治疗组的GSH-PX活性在术后24 h和48 h明显升高（P＜0．05）。见表3。
表1 STBI术前及术后不同时间点血浆中MDA水平比较（±s，n mol／mL）
表1 STBI术前及术后不同时间点血浆中MDA水平比较（±s，n mol／mL）
a：P＜0．05，与同组术前比较；b：P＜0．05，与假手术组比较；c：P＜0．05，与STBI＋NS组比较。
组别 n 术前 术后12 h 术后24 h 术后48 h假手术组20 3．21±0．13 3．56±0．09 3．68±0．08 3．79±0．14 STBI＋NS组 20 3．45±0．16 3．72±0．09 8．25±0．11 ab 18．69±0．05 ab STBI＋HS组 20 3．34±0．06 3．64±0．12 4．71±0．13abc 5．68±0．16 abc
表2 STBI术前及术后不同时间点血浆中SOD活性比较（±s，U／mL）
表2 STBI术前及术后不同时间点血浆中SOD活性比较（±s，U／mL）
a：P＜0．05，与同组术前比较；b：P＜0．05，与假手术组比较；c：P＜0．05，与STBI＋NS组比较。
组别 n 术前 术后12 h 术后24 h 术后48 h假手术组 20 132．61±8．92 135．79±0．02 131．86±8．92 137．13±13．42 STBI＋NS组 20 138．27±6．13 145．63±11．21a 109．12±7．62 ab 92．37±10．61 ab STBI＋HS组 20 135．42±9．21 156．25±5．46 a 121．59±10．13 abc 110．28±9．89 abc
表3 STBI术前及术后不同时间点血浆中GSH-PX活性比较（±s，U／mL）
表3 STBI术前及术后不同时间点血浆中GSH-PX活性比较（±s，U／mL）
a：P＜0．05，与同组术前比较；b：P＜0．05，与假手术组比较；c：P＜0．05，与STBI＋NS组比较。
组别 n 术前 术后12 h 术后24 h 术后48 h假手术组20 0．52±0．01 0．54±0．05 0．53±0．06 0．51±0．03 STBI＋NS组 20 0．48±0．02 0．55±0．04a 0．42±0．03 a 0．39±0．01 a STBI＋HS组 20 0．53±0．03 0．58±0．01 a 0．48±0．02 ab 0．44±0．05 abc
3 讨 论
氧化应激是由于各种内外因素的刺激引起机体组织内或细胞内的氧自由基生成的增多和（或）清除能力降低，从而导致氧自由基在体内或细胞内蓄积，体内过多的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，出现脂质过氧化，造成细胞或组织氧化损伤，从而引起细胞损伤或凋亡，加剧机体的炎性反应［8-9］。MDA是氧自由基攻击细胞膜中多不饱和脂肪酸后生成的脂质过氧化产物，其作为强交联剂，与蛋白质、核酸或脂类结成难溶性物质，使生物膜通透性降低，继而引起细胞破裂和（或）死亡，MDA水平的变化间接反映体内脂质氧化及组织损伤程度且性质较稳定。机体的抗氧化能力取决于脂质过氧化程度和抗氧化保护的动态平衡，目前研究认为SOD、GSH-PX是机体中重要的抗氧化物酶。其中，SOD在机体的氧化与抗氧化平衡中起着关键作用，主要通过清除人体中超氧化物和H2O2，保护细胞生物膜结构和功能的稳定性。谷胱甘肽是一种低分子自由基清除剂，可直接或间接清除H2O2、·OH等，是外源性和内源性的抗氧化剂。当机体血浆中出现MDA含量升高，SOD、GSH-PX下降，一般认为机体出现损伤，引起脂质过氧化，产生了氧化性应激。
目前关于氢气抗氧化作用的研究日益成为国内外学者关注的焦点［10］。氢是无色、无嗅、无味具有低还原性的双原子气体。而近年相关的研究认为，氢气不是生理性惰性气体，而是一种理想的抗氧化物质，具有选择性抗氧化作用，可特异性中和细胞内有害自由基，保护DNA、蛋白质等不被破坏，维持线粒体正常功能，阻止细胞凋亡［11-13］。HS是将氢气通过高压溶解于生理盐水中，关于氢气对机体各种外源性因素引起的氧化应激的影响作用存在不一致的研究结果［14］。任汉强等［11］的研究结果表明，HS对高糖所致内皮细胞氧化损伤具有保护作用，可有效降低人脐静脉内皮细胞内ROS的生成和抗氧化酶减少，发挥抗细胞凋亡的作用。也有研究发现，腹腔注射HS可以显着提高大鼠腹部脏器如肝、肾等组织内的氢浓度，并对脑、肠缺血再灌注损伤动物模型都有较好的保护作用。Matchett等［15］研究结果发现，吸入2%氢气后对中度及重度新生儿缺血缺氧脑病大鼠模型疗效不明显。但是Xie等［16］研究表明，2%氢气吸入对严重脓毒血症小鼠具有保护作用。Ji等［17］研究表明，吸入氢气可通过降低脑组织中氧化产物的产生及提高抗氧化酶活性对TBI大鼠具有显着保护作用。
大量的动物实验表明，TBI后机体的氧自由基反应增强。脑组织在生理情况下清除自由基主要依靠两类物质，酶和天然的抗氧化剂。自由基的生成和清除之间保持动态平衡，以维持机体功能的正常和结构完整，但在某种病理情况下，自由基的生成超出机体清除能力时会造成机体的组织损伤。由于脑组织脂质丰富，抗氧化能力较弱，因此极易受到自由基的攻击而发生氧化应激损伤。控制性皮质撞击损伤模型作为复制局部TBI的成熟模型广泛用于小鼠和大鼠前后脑组织中细胞和分子改变的研究中。因此，本研究采用控制性皮质撞击损伤诱导的TBI模型，结果表明，STBI手术过程中存在一定程度的氧化应激损伤。与术前相比，STBI手术组动物血中MDA水平在颅脑损伤24 h和48 h后显着升高；与术前相比，STBI手术组动物血中的SOD及GSH-PX的活性在颅脑损伤后12 h有所升高，但在STBI 24 h和48 h后显着降低，提示STBI手术过程中机体受到刺激，生成大量氧自由基，引起了机体脂质过氧化，发生了氧化性应激。与STBI＋NS组相比，STBI＋HS治疗可以显着降低STBI伤后MDA的水平，增加STBI术后SOD及GSH-PX的活性。
综上所述，在大鼠STBI模型中，HS治疗可有效降低神经损伤引起的机体氧化产物的生成和抗氧化酶的减少，对氧化应激损伤具有保护作用。采用新的抗氧化剂HS治疗可能成为治疗TBI更有效的治疗策略。
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