王世君，谢婷婷，夏曙华△，周 进，余司文，徐静峰，崔淼淼
(1.贵阳医学院附属医院临床检验科，贵阳 550004；2.贵阳医学院检验学院临床检验教研室，贵阳 550004；3.贵阳医学院附属医院乌当医院检验科，贵阳 550004；4.上海市闸北区中心医院检验科 200070；
5.贵州省贵阳市第二人民医院外科 550000；6.贵州省贵阳市第二人民医院检验科 550000)
论着·基础研究
燃煤型氟中毒对雌鼠血细胞的影响*
王世君1,2，谢婷婷1,2，夏曙华1,2△，周 进3，余司文4，徐静峰5，崔淼淼6
(1.贵阳医学院附属医院临床检验科，贵阳 550004；2.贵阳医学院检验学院临床检验教研室，贵阳 550004；3.贵阳医学院附属医院乌当医院检验科，贵阳 550004；4.上海市闸北区中心医院检验科 200070；
5.贵州省贵阳市第二人民医院外科 550000；6.贵州省贵阳市第二人民医院检验科 550000)
目的 探讨不同染氟剂量在不同时间对雌鼠血细胞的影响。方法 选用SD雌性大鼠按体质量分为对照组(饲以非病区玉米饲料，含氟量为5.2 mg/kg)、中氟组、高氟组(饲以掺入燃煤型氟中毒病区玉米饲料，含氟量分别为47.8、96 mg/kg)，中氟组、高氟组合称染氟组。于染氟60、120、180 d进行血常规检测。结果 染氟60、120 d高氟组白细胞(WBC)较中氟组明显减少(P<0.05)。第60、120天和180天时染氟组红细胞(RBC)较对照组显着减少(P<0.05),染氟组第120天时RBC较第60、180天减少(P<0.05)。染氟60、120 d时染氟组血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)较对照组减低(P<0.05)，第180天时染氟组MCV反而有增高趋势(P<0.05)；染氟组内Hb、HCT染氟120 d均比60、180 d低(P<0.05)；中氟组MCV随时间推移逐渐降低，180 d时显着低于60 d(P<0.05)，高氟组染氟120 d MCV均比60、180 d低(P<0.05)。中氟组内染氟120 d平均血红蛋白含量(MCH)比60、180 d高(P<0.05)，高氟组内染氟180 d时MCH比60 d高(P<0.05)。结论 氟中毒对SD雌鼠的血细胞有不同程度的影响，尤其对红细胞系统的影响最大。染氟早期、中期RBC表现为小RBC高色素性。染氟晚期表现为大细胞高色素性。
血细胞；燃煤型氟中毒；SD雌鼠
长期过量摄入氟会使机体发生氟中毒，这是一种全身性毒物，可累及机体各组织器官，不仅表现在对骨骼和牙齿的损害，对非骨骼组织也具有广泛的毒性作用。有关氟中毒对红细胞(RBC)的报道较多，但对不同染氟剂量和时间对RBC系统和其他血液细胞的研究较少。所以本文以贵州省织金县氟中毒重病区玉米为基础，建立雌鼠燃煤型氟中毒模型，检测其血常规结果，研究雌鼠血细胞随不同染氟剂量、时间的变化情况。
表1 3组SD雌鼠骨氟、尿氟含量变化情况
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 量筒、电子秤、PXJ-1B型氟离子电极(江苏汇分电分析仪器有限公司)、Sysmex K4500型全血细胞分析仪(日本希森美康医用电子株式会社)。EDTA-K2。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立 选用贵阳医学院动物实验中心提供的90只断乳2周，体质量60～80 g的纯系SD雌鼠为研究对象。适应性喂养1周后，按体质量分为对照组、中氟组、高氟组，每组30只。自由饮水，对照组自由食用非病区玉米饲料，含氟量为5.2 mg/kg；中、高氟组饲以掺入不同比例燃煤型氟中毒病区玉米饲料，含氟量分别为47.8、96.0 mg/kg。每天动态观察雌鼠日常情况(毛色、饮水、食用饲料量等)，每周观察雌鼠牙齿的变化。
1.2.2 尿氟检测 分别于染氟60、120、180 d 3个时段收集处死前24 h尿液，根据中华人民共和国卫生行业标准(WS/T 89-1996标准编号)，采用氟离子选择电极法测定尿氟含量。
1.2.3 骨氟检测 大鼠处死后取右侧长骨采用高温灰化-氟离子选择电极法测定骨氟。
1.2.4 氟斑牙的观察 根据大鼠氟斑牙分度标准[1],观察雌鼠氟斑牙发生情况。
1.2.5 血常规检测 染氟60、120、180 d处死前每组选择10只雌鼠尾静脉采血，EDTA-K2抗凝，进行血常规检测。使用配套质控品对全血细胞分析仪进行质控。
2 结果
2.1 动物模型复制结果
2.1.1 氟斑牙发生情况 染氟60、120、180 d对照组氟斑牙均为0只；中氟组分别为6、8、10只；高氟组分别为9、10、10只。
2.1.2 骨氟、尿氟含量变化 见表1。结果表明已成功建立燃煤型氟中毒雌鼠模型。
2.2 血常规检测结果
2.2.1 雌鼠白细胞(WBC)的变化 染氟60 、120 d，高氟组WBC明显低于中氟组(P<0.05)；其余各组间及组内3个时间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。雌鼠WBC变化，见表2。
2.2.2 雌鼠RBC的变化 染氟60、120、180 d，染氟组RBC显着减少(P<0.05)，随染氟剂量增加，RBC有逐渐下降趋势(P>0.05)；各染氟组内RBC在120 d低于同组内60、180 d(P<0.05)。雌鼠RBC变化，见表3。
表2 染氟60、120、180 d雌鼠WBC水平
a：P<0.05，与高氟组比较。
表3 染氟60、120、180 d雌鼠RBC水平
a：P<0.05，与对照组同一时间比较；b：P<0.05，与同组内120 d比较。
2.2.3 雌鼠血红蛋白(Hb)的变化 染氟60、120 d，染氟组Hb与对照组比较明显减低(P<0.05)，180 d染氟组Hb均有增高趋势(P>0.05)；各染氟组内Hb在120 d均低于60、180 d(P<0.05)。雌鼠Hb变化，见表4。
表4 染氟60、120、180 d雌鼠Hb水平
a：P<0.05，与对照组同一时间比较；b：P<0.05，与同组内120 d比较。
2.2.4 雌鼠红细胞压积(HCT)的变化 染氟60、120 d染氟组与对照组比较HCT明显减低(P<0.05)；180 d染氟组HCT均有增高趋势(P>0.05)；各染氟组内HCT在120 d均低于60、180 d(P<0.05)。雌鼠HCT变化，见表5。
表5 染氟60、120、180 d雌鼠HCT水平
a：P<0.05，与对照组同一时间比较；b：P<0.05，与同组内120 d比较。
2.2.5 雌鼠平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)的变化 染氟60、120 d染氟组MCV低于对照组(P<0.05)，染氟180 d染氟组MCV高于同时期对照组，且高氟组还高于中氟组(P<0.05)；中氟组MCV随时间逐渐降低，染氟180 d MCV低于60 d(P<0.05)，高氟组染氟120 d MCV均低于同组内60、180 d(P<0.05)。染氟60、120、180 d各染毒组MCH较对照组显着增加(P<0.05)；中氟组120 d MCH均高于60、180 d(P<0.05)，高氟组在染氟180 d MCH高于同组内60 d(P<0.05)。MCHC在染氟60、120、180 d染氟组均有增高趋势(P>0.05)。雌鼠MCV、MCH、MCHC的变化，见表6。
表6 染氟60、120、180 d雌鼠MCV、MCH、MCHC水平
a：P<0.05，与对照组同一时间比较；b：P<0.05，与同组内120 d比较；c：P<0.05，与高氟组同一时间比较；d：P<0.05，与同组内180 d比较。
2.2.6 雌鼠PLT的变化 染氟60、120、180 d，3组间和组内PLT均无统计学差异(P>0.05)，见表7。
表7 染氟60、120、180 d雌鼠PLT水平
3 讨论
3.1 氟中毒对WBC的影响 不同染氟剂量在不同染氟时间WBC无明显变化。在不同时间段中等染氟剂量可致WBC有增高趋势，而高剂量氟中毒时WBC却有降低趋势，该变化趋势无明显的染氟剂量效应，且趋势不随染氟时间变化而变化。这与王平贵等[2]认为氟中毒后，大鼠的WBC并无规律性变化的结论一致。同时，中等剂量氟中毒时，可能引起WBC的应激性增高，机制有待于进一步研究。高剂量氟中毒时WBC有降低趋势，在染氟早、中期时WBC明显低于中等剂量氟中毒。这可能由于高氟抑制机体的免疫功能，让细胞免疫和体液免疫均受到伤害[3]，而WBC可能发挥防卫功能破坏增加而导致计数减少。另外与采国敬等[4]研究獭兔氟中毒后，WBC的数目明显减少的结论不完全吻合，可能与实验对象、染氟方式、染氟时间等不同有关。
3.2 氟中毒对RBC的影响 染氟组不同时间段RBC出现一致降低的趋势，这与李兴霞等[5]首次报道了鸡氟中毒时RBC的数量会减少相吻合。不同剂量染氟后各时间段RBC均有减少趋势，显示RBC的数量变化与染氟剂量呈正相关。另外，不同剂量染氟组内中期RBC明显低于早、后期，显示氟导致幼年雌鼠RBC减少的毒性作用随其生长发育，机体的各种调节机能不断完善，可代偿性引起RBC增高；然而在染氟后期RBC仍未能达到正常水平。
3.3 氟中毒对Hb的影响 不同剂量染氟早、中期可致Hb明显减低，随染毒剂量的增加，低Hb现象有进一步加重趋势，这与莫非等[6]研究发现高氟能引起大鼠Hb不同程度的降低相吻合。同时Hb与RBC的变化趋势相同，显示氟中毒早、中期可致雌鼠发生贫血。不同染氟剂量在中期时Hb均低于早、后期，而后期Hb均明显上升，显示氟中毒对雌鼠Hb与RBC的毒性作用变化相似，均在氟中毒早期随染氟时间延长而逐渐降低，中期达最低值，然后随生长发育成熟而逐渐增高，但Hb早于RBC恢复正常。
3.4 氟中毒对HCT的影响 染氟早、中期不同染氟剂量均使HCT明显减低，并随染氟剂量的增加呈减低的趋势，这与氟中毒后獭兔HCT的数目明显减少[4]、鸡HCT各试验组皆不同程度低于对照组[7]、紫兰兔HCT与试验前比较也有明显降低[8]的结果相似。不同染氟剂量在中期HCT均低于早、后期，而后期时HCT有增高趋势，显示雌鼠HCT的变化与Hb、RBC变化相同，但后期HCT与Hb均早于RBC恢复正常，其机制有待进一步研究。
3.5 氟中毒对MCV、MCH、MCHC的影响 染氟早、中期MCV明显减低，MCH显着增加，均随染毒剂量的增加而有加重趋势，MCHC有增高趋势，显示染氟早期RBC表现为体积缩小而平均每个RBC内的Hb含量增加，呈小RBC高色素性改变。染氟后期MCH在不同剂量染氟时增高，MCV仅在高剂量染氟时增高，MCHC有增高趋势，显示染氟晚期RBC表现为体积增大而平均每个RBC内的Hb含量增加，呈大RBC高色素性改变。随染毒时间的延长，中等剂量染氟使MCV逐渐降低，MCH早中期逐渐增高，但后期反而降低，显示中氟组的小RBC改变与染毒时间呈正相关，而平均每个RBC内的Hb含量的变化与染毒时间呈先高后低的变化。高剂量染氟使MCV中期明显低于早、后期，MCV呈先低后高的变化。由此可见不同剂量染氟组间MCV、MCH随染氟时间的变化无明显相关性。文献报道燃煤型地方性氟中毒病区儿童发铁低于非病区，高氟区晶体铁明显低于对照组说明氟中毒患者有缺铁性贫血现象[9]。缺铁性贫血的RBC呈小RBC低色素性形态改变，与本研究中雌鼠染氟早、中期RBC减少，Hb、HCT、MCV降低，MCH增高，RBC表现为小RBC高色素的形态改变不吻合，这可能与过量的氟可抑制铁代谢，使铁生成不足铁含量降低[10]，Hb不同程度的降低[6]而致呈小RBC形态改变；小RBC高色素的形态改变可能是过量的氟导致大鼠RBC变形，RBC出现数目不等棘状突起，有的RBC甚至变成棘状球，这是氟抑制了RBC膜上的Na+,K+-ATP酶活性，使RBC内的ATP含量减少，导致膜的钠泵、钙泵运输障碍，膜内离子浓度改变，使原来散在于膜内的血影素和肌动蛋白分子互相连接成网，细胞膜遂突起成棘状有关[11]。雌鼠染氟后期RBC仍减少，Hb、HCT、MCV、MCH却均增高，MCHC正常，显示染氟后期的氟中毒表现为大RBC高色素性形态改变，这与巨幼细胞性贫血的RBC形态分类特点很相似，提示氟中毒晚期可能影响叶酸、VitB12吸收，使其造血原料不足，RBC DNA合成减慢，细胞核分裂迟缓，造成细胞分裂障碍而引起大RBC高色素性贫血，这未见文献报道，还需要研究进一步证实。
3.6 氟中毒对PLT的影响 氟中毒对雌鼠PLT无明显毒性作用，这与采国敬等[4]用NaCl溶液连续灌胃5 d，观察獭兔氟中毒后PLT数目明显减少的报道不相吻合，这可能与研究对象、造模方式、染氟时间不同有关。
综上所述,氟中毒对SD雌鼠的血细胞有不同程度的影响，尤其对RBC系统的影响最大，染氟早、中期氟中毒表现为小RBC高色素贫血的改变。染氟晚期氟中毒表现为大RBC高色素贫血的改变。
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Effects of coal-buring caused fluorosis on blood cells of female SD rats*
WangShijun1,2,XieTingting1,2,XiaShuhua1,2△,ZhouJin3,YuSiwen4,XuJingfeng5,CuiMiaomiao6
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004,China;2.ClinicalTeachingandResearchSection,InstituteofInspection,GuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,TheAffiliatedWudangHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004,China;4.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiZhabeiCentrlHospital,Shanghai200070,China; 5.DepartmentofSurgery,GuiyangSecondPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550000,China; 6.DepartmentofClinicalLaboratory,GuiyangSecondPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550000,China)
Objective To study the relationship between the complete blood count (CBC) and coal-buring caused fluorosis of female rats.Methods Female SD rats were randomly divided into three groups:control group,medium-fluorine group and high-fluorine group.Rats in each exposed group were fed with fodder containing different proportions of corn dried by burning coal from fluorosis endemic areas to establish coal-burning fluorosis model (fluoride of fodder were 47.8 mg/kg and 96 mg/kg).The corn of control group′s fodder was collected from non endemic areas (fluoride was 5.2 mg/kg).At 60 days,120 days and 180 days,the tail vein bloods were analyzed with automated analyzer.Results Compared with medium-fluorine group,the WBC of high-fluorine group decreased at 60 d and 120 d(P<0.05).Compared with control group,the RBC of fluoride treated groups decreased at each time point (P<0.05),especially at 120 d.At 60 d and 120 d,the Hb,HCT and MCV decreased(P<0.05).At 180 d,only the MCV of high-fluorine group increased obviously(P<0.05).At 120 d,the Hb,HCT of fluoride treated groups were less than those at 60 d and 180 d (P<0.05).The MCV of high-fluorine group was same as above(P<0.05).At 180 d,the MCV of medium-fluorine group decreased less than that at 60 d (P<0.05).The MCH of fluoride treated groups increased at each time point (P<0.05).At 120 d,the MCH of medium-fluorine group increased more than its at 60 d and 180 d (P<0.05).At 180 d,the MCH of higher-fluorine group increased than those at 60 d (P<0.05).Conclusion Fluorosis has varied influence on blood cell of SD rats，especially on red blood cell system.In the early and mid stages,the coal-buring caused fluorosis showed the small RBC high pigment anemia.In the late stage,the coal-buring caused fluorosis showed the big RBC high pigment anemia.
blood cell；coal type fluorosis;female SD rats
10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.005
国家自然科学基金资助项目(30460122)；贵州省科技厅基金项目[黔科合LG字(2011036)、黔科合J字(20112277)]；高等学校特色专业建设点(教高函[2010]15号)。 作者简介：王世君(1980-)，主管检验师，硕士，主要从事地方病及肿瘤研究。△
,E-mail：xsh523@126.com。
R599
A
1671-8348(2015)05-0590-03
2014-09-08
2014-10-10)
